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血凝實(shí)驗(yàn)操作報(bào)告
在人們越來越注重自身素養(yǎng)的今天，需要使用報(bào)告的情況越來越多，報(bào)告具有成文事后性的特點(diǎn)。其實(shí)寫報(bào)告并沒有想象中那么難，下面是小編整理的血凝實(shí)驗(yàn)操作報(bào)告，僅供參考，歡迎大家閱讀。
血凝實(shí)驗(yàn)操作報(bào)告 篇1
禽流感血凝-血凝抑制試驗(yàn)操作方法及注意事項(xiàng)
禽流感血凝和血凝抑制試驗(yàn)可用于血清中抗體水平的監(jiān)測，也可用于判斷未使用疫苗群體的感染狀態(tài)等。該試驗(yàn)是目前世界衛(wèi)生組織和國際動(dòng)物健康組織進(jìn)行全球流感監(jiān)測所普遍采用的方法，而且因其具有經(jīng)濟(jì)、快速、可靠、操作簡便、能夠處理大量的樣品，并能在短時(shí)間內(nèi)報(bào)告禽流感抗體水平等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為當(dāng)前基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室禽流感疫病監(jiān)測和免疫抗體檢測中最為常用的方法。但因該試驗(yàn)受人為操作影響較大，經(jīng)常因操作不規(guī)范、不嚴(yán)謹(jǐn)?shù)仍斐山Y(jié)果偏差大、重復(fù)性差等問題，現(xiàn)根據(jù)幾年來的工作經(jīng)驗(yàn)對該試驗(yàn)過程中應(yīng)注意的事項(xiàng)做一探討。
一、 血凝試驗(yàn)操作程序
1、取96孔90°V形酶標(biāo)板，用微量移液器在第一至第五排的1~12孔每孔加25 μL PBS液。
2、吸取25 μL標(biāo)準(zhǔn)禽流感抗原加入到第一排第1孔中充分混勻。
3、從第1孔吸取25 μL混勻后的抗原液加到第2孔中，混勻后吸取25μL加入到第3孔中，依次進(jìn)行倍比稀釋至第二排最后一孔即第24孔，最后棄去25 μL。第三排孔至第四排孔同上操作。
4、依次向第一至第五排孔的每孔中加入25 μL 1%的雞紅細(xì)胞懸液。
5、將酶標(biāo)板置于微量振蕩器上振蕩10秒，室溫（20-25℃）靜置30 min觀察結(jié)果（如果環(huán)境溫度太高，可置4℃環(huán)境下）。
6、結(jié)果判定：將板作45°傾斜，觀察紅細(xì)胞是否呈淚滴狀流淌。以完全凝集（不流淌）的抗原或病毒最高稀釋倍數(shù)為1個(gè)血凝單位（HAU）
二、血凝抑制試驗(yàn)操作程序
1、根據(jù)血凝試驗(yàn)結(jié)果配制4HAU抗原。（即1HAU抗原除以4）
2、取96孔V形酶標(biāo)板，用移液器在第1~12孔各加入25 μL PBS。
3、在第1孔加入25 μL被檢血清，充分混勻后移出25 μL加至第2孔，依次類推，倍比稀釋至第12孔，棄去25 μL。
4、按以上步驟加入陽性血清和陰性血清（各做兩份），作對照孔。
5、在第1~12孔各加入25 μL 4單位抗原，置于微量振蕩器上輕輕混勻，室溫20-25℃下靜置30 min。
6、每孔加入25 μL 1%的雞紅細(xì)胞懸液。置于微量振蕩器上輕輕混勻，室溫（20-25℃）靜置40 min后觀察結(jié)果，若環(huán)境溫度過高，可于4℃條件下進(jìn)行，紅細(xì)胞將呈明顯的紐扣狀沉到孔底。
7、結(jié)果判定：只有陰性對照孔血清滴度不大于2 log2，陽性對照孔誤差不超過1個(gè)滴度，試驗(yàn)結(jié)果才有效。 將酶標(biāo)板作45°傾斜，以完全抑制紅細(xì)胞凝集的最大稀釋倍數(shù)判為該血清的血凝抑制滴度。當(dāng)被檢血清效價(jià)大于等于4log2，判為禽流感抗體陽性。
三、試驗(yàn)過程中的注意事項(xiàng)
1樣品的保存及試驗(yàn)前處理
1.1 采集的血液樣品應(yīng)及時(shí)分離血清，最好分裝至離心管中，標(biāo)記清楚，離心后吸出血清，對應(yīng)編號冷藏送檢，并禁止運(yùn)輸過程中劇烈震動(dòng)。
1.2 一般情況下，在5天內(nèi)檢測的樣品可放置在4℃的冰箱中冷藏，否則低溫冷凍保存。
1.3 在檢測前血清樣品應(yīng)充分混勻，混勻時(shí)采用上下緩慢顛倒幾次的方法即可，切忌劇烈振蕩而引起產(chǎn)生氣泡及血清中蛋白變性。
1.4 對出現(xiàn)膠凍狀的血清樣品，可采用反復(fù)攪動(dòng)幾下再離心的方法有助于緩解該狀態(tài)。膠狀物是含纖維蛋白和纖維蛋白原的血清，可能是由于放置時(shí)間不夠造成的血清未完全析出狀態(tài)。不建議直接吸取其中少量的清亮血清。
1.5 水禽等樣品為排除非特異性反應(yīng)，還應(yīng)相應(yīng)進(jìn)行滅能反應(yīng)。具體操作方法：56℃水浴鍋30min或加等量10%雞紅細(xì)胞，輕搖后靜置30分鐘，離心，收集上清液即可。
2器材的選擇
2.1 酶標(biāo)板的選擇：
建議使用96孔90°V型板進(jìn)行試驗(yàn)，通過反復(fù)試驗(yàn)證明：90°V型板相對于110°板及130°板來講，具有紅細(xì)胞沉降速度快，產(chǎn)生的凝集圖像清晰、結(jié)果容易判定等優(yōu)點(diǎn)。
2.2 移液槍的選擇及使用：
�、賳蔚馈⒍嗟揽烧{(diào)微量移液槍應(yīng)選擇合適的量程，以便精確度的提高。
�、谑褂脮r(shí)應(yīng)采用一檔吸液二檔排液的方法。吸取液體時(shí)，槍頭要深入液下緩慢平穩(wěn)吸液。加緩沖液時(shí)
應(yīng)加在板孔底部。倍比稀釋血清時(shí)，應(yīng)每孔至少反復(fù)吹吸6次，以便混合均勻，還應(yīng)注意盡量避免產(chǎn)生泡沫引起混合不均。加抗原及紅細(xì)胞時(shí)應(yīng)在板內(nèi)液面上方加樣，以免交叉污染，影響試驗(yàn)結(jié)果。
�、奂訕�、倍比稀釋時(shí)應(yīng)高度集中注意力，以免漏加、重復(fù)加樣等。
3試劑的保存及配置
3.1 禽流感血凝抑制試驗(yàn)所用的抗原、陽性血清應(yīng)嚴(yán)格按照說明書的要求進(jìn)行保存和配置，試驗(yàn)前應(yīng)提前將其恢復(fù)至室內(nèi)溫�？乖谋４鏈囟葹�-20℃，反復(fù)凍融會(huì)降低抗原的滴度，應(yīng)避免反復(fù)凍融。
3.2 PH7.2、0.01mol/L的PBS液的制備
①應(yīng)盡量現(xiàn)用現(xiàn)配
�、诿看问褂们皯�(yīng)測PH值，以免時(shí)間過長而導(dǎo)致PH值發(fā)生改變。
�、塾捎赑H試紙跨度范圍偏大，PH值不易準(zhǔn)確介定，因此最好采用酸度計(jì)準(zhǔn)確測量PH值，以提高試驗(yàn)的精確度。
�、苋吭囼�(yàn)均采用同一種稀釋液。
3.3 1%紅細(xì)胞的制備
�、贋楸苊庥行╇u只的紅細(xì)胞有自凝現(xiàn)象，因此配制1%紅細(xì)胞懸液時(shí)應(yīng)最好選擇采取2-3只SPF雞或未進(jìn)行過任何免疫過的成年公雞血液。當(dāng)然采血的前提條件是要按十分之一采血量比例在一次性注射器中加入抗凝劑，如肝素、枸椽酸鈉、檸檬酸鈉等。
�、诓裳戤吅笞詈梅盅b至2ml容量的圓底離心管中，因?yàn)橥ㄟ^2ml與1.5ml兩種容量離心管相比較，放入1.5ml尖底離心管中的話，離心后，離心管底部紅細(xì)胞不易與加入的PBS液混勻，易沉積在管底部，達(dá)不到洗脫干凈的'目的。
�、劢�(jīng)2000~3000r/min，5~10min，棄去上液和紅細(xì)胞上層的白細(xì)胞薄膜，再加入十倍以上血量的PBS液，上下緩慢顛倒（切忌用力過大使紅細(xì)胞破裂），使其充分混勻，再離心棄去上清液，反復(fù)幾次直至上清液清亮透明為止。
�、茉诩蛹t細(xì)胞過程中還須不斷輕搖以確保紅細(xì)胞均勻，使其每孔加入相同數(shù)量的紅細(xì)胞。
�、葜苽浜玫募t細(xì)胞液如果放置后上清液變紅，說明有溶血，不可再使用。
3.4抗原液的配制
�、傧茸鲅囼�(yàn)測定效價(jià)，以抗原與紅細(xì)胞完全凝集的孔為1HUA抗原，配制4HUA抗原應(yīng)往前推算兩孔，即除以4后的值。
�、诿看巫鲈囼�(yàn)前，必須重新檢測禽流感抗原的血凝效價(jià)，以免效價(jià)發(fā)生改變而導(dǎo)致抗原稀釋倍數(shù)不準(zhǔn)確，從而導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)確。
�、蹫楸ＷC配制的抗原準(zhǔn)確，還要進(jìn)行抗原回滴試驗(yàn)。具體方法：做二排抗原回滴，在兩排的第1~8孔各加25微升PBS，取4HAU抗原25微升加在兩排的第1、第2孔，混勻，從第2孔倍比稀釋至第4孔，棄去25微升，另一排同樣。從第2至第8孔補(bǔ)25微升PBS，以保持75微升總量不變，另一排同樣。兩排的第1至第8孔各加25微升1%紅細(xì)胞，震蕩10秒鐘。靜置30分鐘觀察結(jié)果。這樣在第1孔為4HAU抗原，第2孔為2HAU抗原，第3孔為1HAU抗原，第4孔為1/2HAU抗原，均為75微升總量，第5至第8孔為空白對照。如果抗原回滴試驗(yàn)不成立，應(yīng)相應(yīng)調(diào)整抗原濃度直至回滴試驗(yàn)成立。因?yàn)槿绻乖瓭舛冗^高，則所測定的抗體效價(jià)水平偏低，如果抗原濃度過低，則所測定的效價(jià)偏高。所以不調(diào)整抗原濃度至實(shí)驗(yàn)成立的話會(huì)對結(jié)果有很大影響。
4結(jié)果的判定
每次試驗(yàn)必須設(shè)陽性及陰性（空白）對照血清，判別試驗(yàn)是否成立。判讀結(jié)果時(shí)，將酶標(biāo)板傾斜45°，以孔底沉淀的紅細(xì)胞流動(dòng)性好，呈淚珠樣流淌，邊緣無凝集顆粒為凝集完全抑制。
5試驗(yàn)器具的清洗
每次試驗(yàn)完畢后，應(yīng)將酶標(biāo)板中液體甩凈，然后用自來水反復(fù)沖凈每個(gè)孔，再放入3%NaOH中4小時(shí)，清水反復(fù)沖凈，再放入3%Hcl中4小時(shí)，清水反復(fù)沖凈，再用蒸餾水反復(fù)沖洗幾次，甩干水份，入干燥箱中干燥備用。實(shí)驗(yàn)用燒杯、加樣槽、量筒等也應(yīng)充分洗凈、干燥。以免器具內(nèi)有雜物、污物以及殘留物從而影響試驗(yàn)結(jié)果。
四、小結(jié)
在進(jìn)行禽流感血凝抑制試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)充分考慮到各方面的影響因素，提供的檢測結(jié)果才會(huì)真實(shí)可靠，準(zhǔn)確掌握禽類的免疫抗體水平，進(jìn)而為科學(xué)防控禽流感提供理論依據(jù)。
血凝實(shí)驗(yàn)操作報(bào)告 篇2
一、原理
流感病毒顆粒表面的血凝素（HA）蛋白，具有識別并吸附于紅細(xì)胞表面受體的結(jié)構(gòu)，HA試驗(yàn)由此得名。HA蛋白的抗體與受體的特異性結(jié)合能夠干擾HA蛋白與紅細(xì)胞受體的結(jié)合從而出現(xiàn)抑制現(xiàn)象。
二、應(yīng)用
該試驗(yàn)是目前WHO進(jìn)行全球流感監(jiān)測所普遍采用的試驗(yàn)方法�？捎糜诹鞲胁《痉蛛x株HA亞型的鑒定，也可用來檢測禽血清中是否有與抗原亞型一致的感染或免疫抗體。
三、缺點(diǎn)
只有當(dāng)抗原和抗體HA亞型相一致時(shí)才能出現(xiàn)HI現(xiàn)象，各亞型間無明顯交叉反應(yīng)；除雞血清以外，用雞紅細(xì)胞檢測哺乳動(dòng)物和水禽的血清時(shí)需要除去存在于血清中的非特異凝集素；需要在每次試驗(yàn)時(shí)進(jìn)行抗原標(biāo)準(zhǔn)化；需要正確判讀的技能。
四、試驗(yàn)步驟
1 阿氏（Alsevers）液配制
稱量葡萄糖2.05g、檸檬酸鈉0.8g、檸檬酸0.055g、氯化鈉0.42g，加蒸餾水至100mL，散熱溶解后調(diào)pH值至6.1，
69kPa 15min高壓滅菌，4℃保存?zhèn)溆�。�?.8%枸櫞酸鈉（3.8g枸櫞酸鈉，100ml超純水），101 kPa,20min高壓滅菌，4℃保存?zhèn)溆?保存期1個(gè)月）。
2 10%和1%雞紅細(xì)胞液的制備
2.1采血
用注射器吸取阿氏液約1mL（3.8%枸櫞酸鈉），取至少2只SPF雞（如果沒有SPF雞，可用常規(guī)試驗(yàn)證明體內(nèi)無禽流感和新城疫抗體的雞），采血約2～4mL，與阿氏液混合（3.8%枸櫞酸鈉），放入裝10mL阿氏液（生理鹽水）的離心管中混勻。
2.2 洗滌雞紅細(xì)胞
將離心管中的`血液經(jīng)1500～1800 r/min 離心8分鐘，棄上清液，沉淀物加入阿氏液（生理鹽水），輕輕混合，再經(jīng)1500～1800 r/min離心8分鐘，用吸管移去上清液及沉淀紅細(xì)胞上層的白細(xì)胞薄膜，再重復(fù)2次以上過程后，加入阿氏液20 mL（生理鹽水），輕輕混合成紅細(xì)胞懸液，4℃保存?zhèn)溆�，不超過5天。
2.3 10%雞紅細(xì)胞懸液
取阿氏液保存不超過5天的紅細(xì)胞，在錐形刻度離心管中離心1500～1800 r/min 8分鐘，棄去上清液，準(zhǔn)確觀察刻度離心管中紅細(xì)胞體積(mL)，加入9倍體積(mL)的生理鹽水，用吸管反復(fù)吹吸使生理鹽水與紅細(xì)胞混合均勻。（此步
可省略，直接配制1%紅細(xì)胞）
2.4 1%雞紅細(xì)胞液
取混合均勻的10%雞紅細(xì)胞懸液1 mL，加入9 mL生理鹽水，混合均勻即可。（根據(jù)檢測血清的數(shù)量，估算一下需要的1%雞紅細(xì)胞量，可按0.3ml/每份血清）
3 抗原血凝效價(jià)測定（HA試驗(yàn)，微量法）
3.1 在微量反應(yīng)板的1孔～12孔均加入25μl PBS（生理鹽水），換滴頭。
3.2吸取25μl抗原加入第l孔，混勻。
3.3從第1孔吸取25μl，病毒液加入第2孔，混勻后吸取25μl加入第3孔，如此進(jìn)行倍比稀釋至第11孔，從第11孔吸取25μl棄之，換滴頭。
3.4每孔再加入25μl PBS（生理鹽水）。
3.5每孔均加入25μl 體積分?jǐn)?shù)為1%雞紅細(xì)胞懸液（將雞紅細(xì)胞懸液充分搖勻后加入）。
3.6振蕩混勻，在室溫（20～25℃）下靜置40min后觀察結(jié)果（如果環(huán)境溫度太高，可置4℃環(huán)境下反應(yīng)1小時(shí)）。對照孔紅細(xì)胞將呈明顯的鈕扣狀沉到孔底。
3.7結(jié)果判定 將板傾斜，觀察血凝板，判讀結(jié)果（見下表）。
表1：血凝試驗(yàn)結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)
能使紅細(xì)胞完全凝集（100%凝集，++++）的抗原最高稀釋度為該抗原的血凝效價(jià)，此效價(jià)為1個(gè)血凝單位（HAU）。注意對照孔應(yīng)呈現(xiàn)完全不凝集（-），否則此次檢驗(yàn)無效。
4 血凝抑制（HI）試驗(yàn)（微量法）
4.1 根據(jù)3的試驗(yàn)結(jié)果配制4HAU的病毒抗原。以完全血凝的病毒最高稀釋倍數(shù)作為終點(diǎn)，終點(diǎn)稀釋倍數(shù)除以4即為含4HAU的抗原的稀釋倍數(shù)。例如，如果血凝的終點(diǎn)滴度為1:256，則4HAU抗原的稀釋倍數(shù)應(yīng)是1:64（256除以4）。
4.2 在微量反應(yīng)板的1孔～11孔加入25μl PBS（生理鹽水），第12孔加入50μl PBS（生理鹽水）。
4.3 吸取25μl血清加入第1孔內(nèi)，充分混勻后吸25μl于第2孔，依次倍比稀釋至第10孔，從第10孔吸取25μl棄去。
4.4 1孔～11孔均加入含4HAU抗原25μl，室溫（約20℃）靜置至少30min。
4.5 每孔加入25μl 1%的雞紅細(xì)胞懸液混勻，輕輕混勻，靜置約40min（室溫約20℃，若環(huán)境溫度太高可置4℃條件
下進(jìn)行），對照紅細(xì)胞將呈現(xiàn)鈕扣狀沉于孔底。
4.6 結(jié)果判定
試驗(yàn)成立的條件：只有陰性對照孔血清滴度不大于21og2，陽性對照孔血清誤差不超過1個(gè)滴度，試驗(yàn)結(jié)果才有效。
以完全抑制4HAU抗原的血清最高稀釋倍數(shù)作為HI滴度。
HI價(jià)小于或等于31og2判定HI試驗(yàn)陰性；HI價(jià)大于或等于41og2為陽性。
五、HI試驗(yàn)注意事項(xiàng)
1、合理選擇抗原和對照陽性血清。針對Re-4和Re-5株疫苗免疫采用相應(yīng)抗原和對照陽性血清。
同一亞型的禽流感病毒制成的抗原，如果毒株來源不同，則可能會(huì)存在抗原性差異，從而使檢測同一血清的結(jié)果有差別。一般來講，疫苗種毒株如果與抗原所用毒株相同時(shí)，則所測得的HI效價(jià)較高。
2、合理使用和保存抗原。反應(yīng)試劑要按規(guī)定保存和使用，凍干的試劑應(yīng)按照說明中規(guī)定的體積重新溶解并保存。要避免雜菌污染，因?yàn)槲廴舅斐傻姆橇鞲衅鹪吹哪匾部膳c所有抗血清發(fā)生非特異反應(yīng)。為避免反復(fù)凍融和細(xì)菌污染，可以無菌操作將試劑分裝成小包裝。
3、反應(yīng)溫度不能太高。若在37℃ （如溫箱）下進(jìn)行。
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