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細(xì)胞培養(yǎng)在生物制藥領(lǐng)域的應(yīng)用
本文對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在疫苗生產(chǎn)、單克隆抗體制備、藥物篩選、基因重組產(chǎn)品等生物制藥領(lǐng)域的應(yīng)用作一綜述。
細(xì)胞培養(yǎng)在生物制藥領(lǐng)域的應(yīng)用【1】
【摘 要】經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的研究與實(shí)踐，細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)得到了充分的發(fā)展與完善，離體培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞具有可以人為控制的培養(yǎng)條件且結(jié)果便于觀察的特點(diǎn)，因而被廣泛應(yīng)用于生物制藥領(lǐng)域中并對(duì)該領(lǐng)域產(chǎn)生了巨大而深遠(yuǎn)的影響。
本文對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在疫苗生產(chǎn)、單克隆抗體制備、藥物篩選、基因重組產(chǎn)品等生物制藥領(lǐng)域的應(yīng)用作一綜述。
【關(guān)鍵詞】細(xì)胞培養(yǎng) 生物制藥 應(yīng)用
隨著生命科學(xué)理論和技術(shù)的飛速發(fā)展，細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的地位和作用日益成熟，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的研究取得了可觀的效果，并且有著無(wú)限的應(yīng)用發(fā)展前景。
主要的發(fā)展目標(biāo)包括：開(kāi)發(fā)生長(zhǎng)密度高、目標(biāo)產(chǎn)品分泌量大的細(xì)胞系;研制性能優(yōu)良、吸附與解離容易、重復(fù)利用的微載體;開(kāi)展規(guī)�；纳锓磻�(yīng)器、檢測(cè)系統(tǒng)、細(xì)胞培養(yǎng)與產(chǎn)物分離耦合系統(tǒng)等;設(shè)計(jì)新型培養(yǎng)基促進(jìn)生物制品安全;研究三維細(xì)胞的培養(yǎng)條件[1]。
生物制藥即運(yùn)用生物化學(xué)、醫(yī)學(xué)、微生物學(xué)等原理和方法，利用生物機(jī)體、組織、細(xì)胞、體液等生產(chǎn)具有預(yù)防、診斷和治療功能的藥物制品。
有關(guān)研究者采用基因重組技術(shù)或其他創(chuàng)新生物技術(shù)生產(chǎn)治療性藥物，主要產(chǎn)品有基因工程藥物、抗體工程藥物、疫苗等幾類(lèi)。
這些產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)研制及生產(chǎn)過(guò)程都離不開(kāi)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。
1 疫苗生產(chǎn)
疫苗免疫是最有效的預(yù)防感染性疾病的措施之一。
疫苗免疫是指利用病毒性制劑、細(xì)菌性制劑及類(lèi)毒素等人工主動(dòng)免疫制劑，通過(guò)作用于機(jī)體的免疫防御系統(tǒng)起到免疫應(yīng)答作用。
傳統(tǒng)的流感疫苗生產(chǎn)多采用雞胚培養(yǎng)，但當(dāng)面臨高致病性流感全球大流行、微生物感染、內(nèi)毒素殘余量多等問(wèn)題時(shí)，傳統(tǒng)的雞胚生產(chǎn)方法可能難以滿(mǎn)足疫苗市場(chǎng)的需求。
隨著細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的完善及其優(yōu)點(diǎn)的體現(xiàn)積極推進(jìn)使用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)替代雞胚培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)流感疫苗，未來(lái)將會(huì)越來(lái)越多依靠細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)獲得理想的疫苗。
與此同時(shí)也存在一些缺陷，尤其是哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的病毒疫苗特別適合于工業(yè)的發(fā)展，應(yīng)用微載體大規(guī)模培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)流感疫苗，使得流感病毒適應(yīng)傳代細(xì)胞(如VERO細(xì)胞)，該細(xì)胞不僅培養(yǎng)條件要求不高而且遺傳性狀穩(wěn)定，對(duì)多種病毒的感染敏感[2]，如利用生物反應(yīng)器大規(guī)模進(jìn)行病毒繁殖，可實(shí)現(xiàn)流感疫苗的規(guī)�；a(chǎn)。
MDCK細(xì)胞系是被公認(rèn)為最適于生產(chǎn)甲、乙型流感病毒疫苗的細(xì)胞系，對(duì)流感病毒增殖快、感染效率高，且不易變異[3]。
其中典型代表，如巴斯德公司利用1000L反應(yīng)器微載體培養(yǎng)Vero細(xì)胞生產(chǎn)人用狂犬病疫苗和脊髓灰質(zhì)炎疫苗。
由此可見(jiàn)，利用細(xì)胞培養(yǎng)疫苗已成為目前疫苗研制的重要應(yīng)用方向。
2 單克隆抗體制備
單克隆抗體是由單一B淋巴細(xì)胞克隆產(chǎn)生的高度均一、僅針對(duì)某一特定抗原表位的抗體。
研究Hb在帕金森病中的發(fā)病機(jī)制，李旭穎等[4]制備抗Hb單克隆抗體，由重組人Hb作為抗原免疫小鼠，并將其細(xì)胞融合及細(xì)胞培養(yǎng)制備成雜交瘤，經(jīng)過(guò)篩選獲得抗人Hb單克隆抗體雜交瘤株，體內(nèi)誘生法制備腹水經(jīng)過(guò)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等方法進(jìn)而獲得特異性抗Hb單克隆抗體。
張培等[5]制備乙型腦炎病毒的單克隆抗體通過(guò)動(dòng)物免疫、細(xì)胞融合、克隆和篩選等方法，應(yīng)用ELISA等免疫學(xué)方法進(jìn)行特異性和亞型的鑒定，為快速檢測(cè)方法的建立奠定了基礎(chǔ)。
單克隆抗體藥物研發(fā)已經(jīng)被列入863計(jì)劃和國(guó)家重點(diǎn)項(xiàng)目，國(guó)內(nèi)已經(jīng)有2個(gè)治療性單抗產(chǎn)品準(zhǔn)備生產(chǎn)，3個(gè)治療性產(chǎn)品處于臨床試驗(yàn)階段，多個(gè)抗體藥物處于臨床研究階段，已經(jīng)批準(zhǔn)的治療性單抗有31個(gè)，目前國(guó)內(nèi)正在進(jìn)行臨床前研究的抗體藥物有：抗CEA嵌合抗體;抗破傷風(fēng)抗體及抗乙型腦炎等[6]。
3 藥物篩選
藥物篩選是從天然或合成的化合物中篩選出高效的新藥或先導(dǎo)化合物。
生物活性和藥理作用檢測(cè)所篩選出的高效的新藥或先導(dǎo)化合物，并根據(jù)檢測(cè)結(jié)果評(píng)價(jià)某一物質(zhì)的藥用前景，是新藥研究的最初過(guò)程和關(guān)鍵步驟。
體外二維和應(yīng)用球狀聚集體、細(xì)胞片層、脫細(xì)胞基質(zhì)進(jìn)行三維培養(yǎng)肝細(xì)胞的具體技術(shù)是進(jìn)行藥物毒性檢測(cè)的重要途徑[7]。
Kostadinava等建立了一種長(zhǎng)時(shí)間的三維肝細(xì)胞共培養(yǎng)體系，比單層培養(yǎng)肝細(xì)胞能更好地檢測(cè)體內(nèi)藥物導(dǎo)致的毒性。
細(xì)胞水平的藥物篩選更接近人體生理狀態(tài)，外界環(huán)境干擾少，準(zhǔn)確率高，是細(xì)胞水平藥物篩選模型的核心技術(shù)高內(nèi)涵篩選。
高內(nèi)涵藥物篩選主要在微陣列多孔板上完成，通過(guò)在微孔板上進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，施加藥物刺激進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作和數(shù)據(jù)的采集和分析。
HCS技術(shù)可完成各種對(duì)于細(xì)胞生理現(xiàn)象本質(zhì)的研究，Talyor等[8]提出高內(nèi)涵概念，HCS模型主要建立在細(xì)胞水平，通過(guò)觀察樣品對(duì)固定或動(dòng)態(tài)細(xì)胞的多個(gè)功能的作用，涉及各種不同的靶點(diǎn)，從多個(gè)角度分析樣品的作用，最終確定樣品的活性和可能的毒性。
近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的微流控芯片技術(shù)有可能成為細(xì)胞水平藥物篩選的理想選擇。
Ye等[9]構(gòu)建了一套用于細(xì)胞水平藥物篩選研究的集成化微流控芯片系統(tǒng)，它可以將細(xì)胞種植、培養(yǎng)、標(biāo)記、加藥、梯度稀釋等操作通過(guò)微通道網(wǎng)絡(luò)流體控制技術(shù)集成到一張芯片完成，保持了細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性，可全面記錄細(xì)胞對(duì)藥物刺激的各種反應(yīng)。
4 基因重組產(chǎn)品
基因工程藥物是將人某一部位的基因，注入到質(zhì)粒中，然后導(dǎo)入工程菌或工程細(xì)胞中，經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)或細(xì)菌培養(yǎng)，充分表達(dá)擴(kuò)增后，分離，純化而得。
基因重組產(chǎn)品與天然型的生物學(xué)活性一致，其結(jié)構(gòu)分為兩種，一種與天然型的一樣;另一種稍有區(qū)別，如人白細(xì)胞介素是糖蛋白質(zhì)，但糖鏈的有無(wú)對(duì)其機(jī)能無(wú)影響，故重組的不含糖鏈。
哺乳動(dòng)物細(xì)胞已成為生物制藥最重要的表達(dá)或生產(chǎn)系統(tǒng)，F(xiàn)DA(美國(guó)食品藥品管理局)在2000年以后批準(zhǔn)的創(chuàng)新生物技術(shù)藥物，用酵母表達(dá)的有2種，用大腸桿菌表達(dá)的產(chǎn)品只有4種，而通過(guò)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)的生物技術(shù)產(chǎn)品則有22種，除兩種組織工程產(chǎn)品外，其余都是蛋白類(lèi)產(chǎn)品，這些蛋白都是分子量大、二硫鍵多、空間結(jié)構(gòu)復(fù)雜的糖蛋白，只有使用CHO等哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，這些蛋白的生產(chǎn)才成為可能。
建立CHO細(xì)胞表達(dá)的重組人白細(xì)胞介素-12(rhIL-12)的純化工藝，趙峰等[10]取高效表達(dá)rhIL-12的CHO工程細(xì)胞培養(yǎng)上清液，分離純化、定量計(jì)算、對(duì)純化產(chǎn)品進(jìn)行鑒定及檢測(cè)rhIL-12的生物活性，經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)純化產(chǎn)物回收率和純度高，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。
細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)在生物制藥中的應(yīng)用【2】
【摘 要】動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基是體外細(xì)胞培養(yǎng)的重要因素,能夠影響細(xì)胞生長(zhǎng)。
它是利用動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)和擴(kuò)增來(lái)生產(chǎn)生物產(chǎn)品，或者作為發(fā)現(xiàn)和測(cè)試新的工具。
為此本文就動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基的發(fā)展及應(yīng)用進(jìn)行了簡(jiǎn)要的介紹。
【關(guān)鍵詞】生物制藥;動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng);應(yīng)用
一、動(dòng)物細(xì)胞的特點(diǎn)及生長(zhǎng)特性
動(dòng)物細(xì)胞雖可像微生物細(xì)胞一樣，在人工控制條件的生物反應(yīng)器中進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，但其細(xì)胞結(jié)構(gòu)和培養(yǎng)特性與微生物細(xì)胞相比，有顯著差別：①動(dòng)物細(xì)胞比微生物細(xì)胞大得多，無(wú)細(xì)胞壁，機(jī)械強(qiáng)度低，對(duì)剪切力敏感，適應(yīng)環(huán)境能力差;②倍增時(shí)間長(zhǎng)，生長(zhǎng)緩慢，易受微生物污染，培養(yǎng)時(shí)須用抗生素;③培養(yǎng)過(guò)程需氧量少;④培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞相互粘連以集群形式存在;⑤原代培養(yǎng)細(xì)胞一般繁殖50代即退化死亡;⑥代謝產(chǎn)物具有生物活性，生產(chǎn)成本高，但附加值也高。
二、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展
動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)大分子的生物制品起始于20世紀(jì)60年代，當(dāng)時(shí)是為了滿(mǎn)足生產(chǎn)疫苗的需要。
后來(lái)隨著大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的逐漸成熟和轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用，人們發(fā)現(xiàn)利用動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)來(lái)生產(chǎn)大分子藥用蛋白質(zhì)比原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)更有優(yōu)越性。
因?yàn)橹亟MDNA技術(shù)修飾過(guò)的動(dòng)物細(xì)胞能夠正常地加工、折疊、糖基化、轉(zhuǎn)運(yùn)、組裝和分泌由插入的外源基因所編碼的蛋白質(zhì)，而細(xì)菌系統(tǒng)的表達(dá)產(chǎn)物則常以沒(méi)有活性的包含體形式存在。
隨著大量永生性細(xì)胞株的創(chuàng)建，在商業(yè)利益的刺激下，動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)也迅速發(fā)展起來(lái)，并被應(yīng)用到生產(chǎn)實(shí)際。
動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)主要用于生產(chǎn)激素、疫苗、單克隆抗體、酶、多肽等功能性蛋白質(zhì)，以及皮膚、血管、心臟、大腦、肝、腎、腸等組織器官。
它在醫(yī)藥工業(yè)和醫(yī)學(xué)工程的發(fā)展中占重要地位。
大規(guī)模動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)藥物產(chǎn)品將是生物制藥領(lǐng)域的一個(gè)很重要的方面，具有重大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。
生物技術(shù)在過(guò)去10年有顯著增長(zhǎng)，并繼續(xù)快速發(fā)展，今后幾十年內(nèi)還將有更多的蛋白質(zhì)、抗體、多肽類(lèi)藥物由動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)來(lái)生產(chǎn)。
隨著生物技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，開(kāi)發(fā)的動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)生物制品的種類(lèi)的增多及產(chǎn)品周期短、安全高等優(yōu)點(diǎn)，利用動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)生物制品凸顯其優(yōu)越性的發(fā)展越來(lái)越快。
三、大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用
近幾年來(lái)，已把巨大的人力和資金投入到開(kāi)發(fā)大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)上，將能加快發(fā)展步伐，進(jìn)一步應(yīng)用遺傳修飾的哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)單克隆抗體和其他精細(xì)的糖蛋白。
獲得有藥物作用的蛋白質(zhì)是十分復(fù)雜的過(guò)程，要求分子有精確的折疊和糖基化，這些要求在細(xì)菌和酵母體內(nèi)卻難以得到滿(mǎn)足。
然而，采用雜交瘤和重組DNA技術(shù)往往可以使動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生和分泌出一定數(shù)量的有用蛋白質(zhì)。
大規(guī)模的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)在藥物產(chǎn)品的生產(chǎn)方面具有重大的價(jià)值。
1.疫苗
在疫苗產(chǎn)業(yè)早期，往往利用動(dòng)物來(lái)生產(chǎn)疫苗，如用家兔人工感染狂犬病毒生產(chǎn)狂犬疫苗，用奶牛來(lái)生產(chǎn)天花疫苗，用某些細(xì)菌接種到動(dòng)物身上來(lái)生產(chǎn)抵抗該種細(xì)菌的疫苗。
早在20世紀(jì)50年代，已經(jīng)能夠利用動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)病毒。
先在反應(yīng)器中大規(guī)模培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞，待細(xì)胞長(zhǎng)到一定密度后.接種病毒，病毒利用培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行復(fù)制，從而生產(chǎn)大量的病毒。
這一突破是動(dòng)物細(xì)胞工程的真正開(kāi)始。
雖然動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)發(fā)展迅速，大大降低了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的用量，提高廠生產(chǎn)效率，但由于原代細(xì)胞增殖能力有限，一般只能通過(guò)簡(jiǎn)單增加動(dòng)物的數(shù)量來(lái)增加產(chǎn)量。
而使用具有無(wú)限增殖潛力的細(xì)胞系，則使疫苗的生產(chǎn)得到飛躍式的進(jìn)展。
某些來(lái)自人體或動(dòng)物體內(nèi)的細(xì)胞，在一定條件下的體外培養(yǎng)后，可以獲得無(wú)限增殖的潛力，用它們來(lái)生產(chǎn)疫苗可以大大降低實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的用量。
更為重要的是，用動(dòng)物細(xì)胞體外大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)的疫苗可以保證質(zhì)量，因?yàn)樗玫募?xì)胞性質(zhì)均一，經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的安全檢驗(yàn)，克服了動(dòng)物個(gè)體間的差異造成的疫苗質(zhì)量不穩(wěn)定的問(wèn)題，并且大大降低了來(lái)自動(dòng)物的病原體傳染使用者的可能性。
用類(lèi)似的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)可生產(chǎn)酶、細(xì)胞因子、抗體等生物制品，其先決條件是能夠獲得可分泌目標(biāo)蛋白的細(xì)胞系。
但是，在基因工程技術(shù)出現(xiàn)之前，細(xì)胞表達(dá)蛋白的水平很低，因而用這種工藝生產(chǎn)蛋白制品產(chǎn)量低、成本高，因此早期的動(dòng)物細(xì)胞技術(shù)只用于疫苗及少量的干擾素和尿激酶的生產(chǎn)。
基因重組技術(shù)和雜交瘤技術(shù)大大促進(jìn)了動(dòng)物細(xì)胞技術(shù)的進(jìn)步及其在工業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用，使動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)在生產(chǎn)疫苗中越來(lái)越重要。
傳統(tǒng)上一直把細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)物用于人類(lèi)和牲畜的病毒疫苗，這些疫苗至今己被大規(guī)模應(yīng)用。
口蹄疫疫苗是大規(guī)模動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方法生產(chǎn)的主要產(chǎn)品之一。
1983年，英國(guó)Wellcome公司就已能夠利用動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)口蹄疫疫苗。
美國(guó)Genentech公司應(yīng)用SV40為載體，將乙型肝炎病毒表面抗原基因插入哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行高效表達(dá)，已生產(chǎn)出乙型肝炎疫苗。
2.單克隆抗體
單克隆抗體在體外診斷、體內(nèi)造影、人和家畜的治療以及工業(yè)上的應(yīng)用日益廣泛，需要量可達(dá)數(shù)百克。
有些系統(tǒng)的單克隆抗體的需要量在今后幾年內(nèi)將迅速增加到幾公斤的數(shù)量級(jí)。
為此，迫切需要更有效的生產(chǎn)方法。
采用傳統(tǒng)方法(小鼠或大鼠的腹水瘤培養(yǎng)法)生產(chǎn)單克隆抗體，已不能適應(yīng)實(shí)際需要。
應(yīng)用大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)生產(chǎn)各種不同的單克隆抗體是經(jīng)濟(jì)可靠的方法。
如英國(guó)Celltech公司采用10100和10001自動(dòng)氣升式培養(yǎng)系統(tǒng)，培養(yǎng)各種生產(chǎn)單克隆抗體的小鼠、大鼠和人的細(xì)胞株，生產(chǎn)各種單克隆抗體的產(chǎn)品。
到目前為止，已成功地在1000L培養(yǎng)系統(tǒng)中，采用無(wú)血清培養(yǎng)液生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的單克隆抗體。
其他一些國(guó)家先后制備成測(cè)定血和尿中的各種激素、特殊蛋白質(zhì)、血型、各種藥物、診斷細(xì)菌性或病毒性病原等的單克隆抗體診斷試劑盒。
3.基因重組產(chǎn)品
目前已認(rèn)識(shí)到在不久將來(lái)用常規(guī)的微生物學(xué)方法不能實(shí)現(xiàn)遺傳工程的效益，人們對(duì)大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)的興趣愈來(lái)愈大。
動(dòng)物細(xì)胞能精確地轉(zhuǎn)譯和加工較大或更復(fù)雜的克隆蛋白質(zhì)。
此外，動(dòng)物細(xì)胞還可以把人們所需的蛋白質(zhì)分泌到培養(yǎng)液內(nèi)，而從培養(yǎng)液分離蛋白質(zhì)要比細(xì)胞勻漿更為容易。
除了單克隆抗體外，現(xiàn)在人們最感興趣的蛋白質(zhì)是組織型的血纖蛋白溶酶原激劑(t%26mdash;PA)，以及其他的重組分子。
利用動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方式進(jìn)行大量生產(chǎn)，如免疫珠蛋白G、A和M，尿激酶，人生長(zhǎng)激素，乙型肝炎表面抗原等產(chǎn)品均由美國(guó)Endotronic公司用Acusyst%26mdash;P型中空纖維培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行生產(chǎn)。
參考文獻(xiàn)
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[3]唐瑩,馮君.;動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的發(fā)展及應(yīng)用 [J].中國(guó)臨床康復(fù),2006年41期
無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)體系在生物制藥工程中的應(yīng)用【3】
[摘要]作為體外合成蛋白表達(dá)手段的一種，無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)體系有著蛋白合成高效快速、反應(yīng)操縱簡(jiǎn)便等方面的優(yōu)點(diǎn)，在基礎(chǔ)生物學(xué)領(lǐng)域的研究中有著廣泛的應(yīng)用價(jià)值。
無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)體系目前已成功應(yīng)用于重組蛋白藥物的生產(chǎn)。
高通量藥物篩選等領(lǐng)域，為解決生物制藥領(lǐng)域中的難題提供了新的解決思路。
同時(shí)，經(jīng)過(guò)研究人員的不斷努力，對(duì)其在生物制藥工程中的應(yīng)用也取得了新的研究進(jìn)展，顯示出重要的應(yīng)用潛能。
本文基于對(duì)無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)體系的闡述和分析，對(duì)其在生物制藥工程中的應(yīng)用做出了相關(guān)的探討和研究，以期能為生物制藥領(lǐng)域的發(fā)展提供一定的技術(shù)支撐和借鑒。
[關(guān)鍵詞]生物：制藥工程;無(wú)細(xì)胞蛋白;表達(dá)體系;應(yīng)用
隨著生物科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)的前沿領(lǐng)域的研究越來(lái)越關(guān)注，無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)體系(cell-free protein synthesis，CFPS)也因此備受重視。
尤其是近些年來(lái)，無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)體系的研究已逐漸從原核深入到真核的反應(yīng)體系，成本不斷降低。
較之于傳統(tǒng)的體內(nèi)表達(dá)體系，無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)體系基于細(xì)胞提取物，有著不受細(xì)胞的生理限制以及胞內(nèi)蛋白酶的降解、可以在較短的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行大量的毒性蛋白表達(dá)、無(wú)需繁雜的下游處理以及產(chǎn)物的活性增加等諸多方面的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)。
同時(shí)，其在生物制藥中也逐漸體現(xiàn)出了毒性蛋白、復(fù)雜蛋白以及膜蛋白表達(dá)等方面的優(yōu)勢(shì)。
但由于天然蛋白水溶性差、半衰期短等因素的影響，如何實(shí)現(xiàn)重組蛋白的穩(wěn)定表達(dá)，發(fā)揮無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)體系在醫(yī)療方面的應(yīng)用潛力，就成為生物制藥領(lǐng)域的重要研究課題。
因此，本文討論和研究無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)在生物制藥工程中的有效應(yīng)用問(wèn)題，將對(duì)更好地實(shí)現(xiàn)該系統(tǒng)在制藥科學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用潛力的發(fā)揮有著重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。
1.無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)體系概述
作為一種生物學(xué)技術(shù)，傳統(tǒng)的蛋白表達(dá)是基于細(xì)胞體內(nèi)，對(duì)動(dòng)植物細(xì)胞以及細(xì)菌等外源基因的表達(dá)。
而無(wú)細(xì)胞蛋白合成系統(tǒng)是一種全新的蛋白合成方式，實(shí)現(xiàn)了以外源DNA或mRNA為模板，利用細(xì)胞抽取物中的蛋白因子、相關(guān)的酶系等，通過(guò)在體系內(nèi)加入ATP、GTP以及氨基酸、能量再生物質(zhì)等來(lái)實(shí)現(xiàn)蛋白表達(dá)的體外系統(tǒng)(如圖1所示)。
自1982年世界上第一個(gè)重組蛋白藥物胰島素問(wèn)世以來(lái)，重組蛋白藥物由于來(lái)源廣泛，且有著較高的安全性在短短幾十年時(shí)間就實(shí)現(xiàn)了在生物制藥領(lǐng)域的飛速發(fā)展，在全球藥物市場(chǎng)上越來(lái)越占據(jù)著舉足輕重的地位。
表達(dá)重組蛋白藥物最常用的系統(tǒng)包括大腸桿菌、�酒酵母以及中國(guó)的倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞。
但諸如此類(lèi)的體內(nèi)表達(dá)系統(tǒng)往往由于種種原因而導(dǎo)致一些復(fù)雜蛋白不能順利表達(dá)，在這一迫切需求下，無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)便應(yīng)運(yùn)而生。
隨著國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)蛋白合成技術(shù)的深入研究以及蛋白連續(xù)翻譯系統(tǒng)的建立，無(wú)細(xì)胞表達(dá)也有了突破性的研究，實(shí)現(xiàn)了蛋白的連續(xù)表達(dá)。
該系統(tǒng)無(wú)需在活體細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行，基于細(xì)胞提取物就可以實(shí)現(xiàn)連續(xù)的轉(zhuǎn)錄和翻譯，從而快速高效合成目標(biāo)蛋白。
該系統(tǒng)沒(méi)有細(xì)胞壁，也不必關(guān)注維持活體細(xì)胞生命的相關(guān)生化反應(yīng)，在表達(dá)技術(shù)上占據(jù)獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。
同時(shí)，蛋白合成的條件相對(duì)容易調(diào)整，有助于蛋白的表達(dá)和折疊。
依據(jù)這一優(yōu)勢(shì)，無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)體系在生物制藥工程中也較多適用于快速表達(dá)醫(yī)用蛋白、高通量蛋白庫(kù)篩選等復(fù)雜蛋白質(zhì)的合成。
該系統(tǒng)的另一個(gè)優(yōu)勢(shì)是表達(dá)具有毒性的蛋白，由于無(wú)需維持宿主細(xì)胞的活性，也更容易地實(shí)現(xiàn)插入非天然氨基酸的表達(dá)，可較好地被用于研究蛋白的化學(xué)特性中。
因此，隨著近些年來(lái)對(duì)該系統(tǒng)相關(guān)應(yīng)用研究的不斷深入，已經(jīng)逐漸實(shí)現(xiàn)了在生物制藥相關(guān)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，如進(jìn)行多肽類(lèi)藥物、腫瘤疫苗、重組蛋白藥物等大規(guī)模的生產(chǎn)以及高通量藥物的篩選等。
2.無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)體系的分類(lèi)
就目前來(lái)講，已開(kāi)發(fā)出來(lái)的無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)主要包括原核和真核兩種表達(dá)系統(tǒng)類(lèi)型。
兩者由于表達(dá)系統(tǒng)的不同，也存在著不同的特點(diǎn)，在實(shí)際科學(xué)生產(chǎn)研究的過(guò)程中需要根據(jù)不同的需求進(jìn)行兩種表達(dá)系統(tǒng)的恰當(dāng)選擇。
2.1原核系統(tǒng)
對(duì)原核表達(dá)系統(tǒng)的研究由來(lái)已久，該系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白的表達(dá)是利用的原核生物細(xì)胞提取物，最為常見(jiàn)的是大腸桿菌。
由于其具有較強(qiáng)的耐受性，因此在此基礎(chǔ)上建立無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)就具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。
人們?cè)诰唧w進(jìn)行目標(biāo)蛋白的表達(dá)中，可以根據(jù)需要加入蛋白酶抑制劑以及標(biāo)記蛋白等特殊添加劑，在含有雜質(zhì)的情況下依舊可以進(jìn)行目標(biāo)蛋白的表達(dá)。
其不足之處在于在進(jìn)行蛋白的翻譯加工后，在正確折疊方面現(xiàn)階段仍是較大的困難。
不過(guò)由于大腸桿菌材料來(lái)源廣泛，成本較低，也存在著較高的表達(dá)效率，因此在體外表達(dá)系統(tǒng)研究中仍是較為熱門(mén)的話題。
2.2真核系統(tǒng)
真核表達(dá)系統(tǒng)是與原核表達(dá)相對(duì)應(yīng)的系統(tǒng)，其進(jìn)行目標(biāo)蛋白的表達(dá)，利用的是真核生物細(xì)胞提取物。
其中，最為常見(jiàn)的就是麥芽提取物和兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解液。
與上述表達(dá)系統(tǒng)不同的是，真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)不存在基因的非特異性激活或者抑制，因此能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)調(diào)控基因的高效表達(dá)。
在該表達(dá)系統(tǒng)中，為保證得到性質(zhì)相對(duì)穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，實(shí)現(xiàn)真核細(xì)胞基因組的整合，也常需要將環(huán)狀的模板線性化，以保證合成效率不斷加強(qiáng)。
經(jīng)過(guò)相關(guān)學(xué)者的實(shí)踐研究證實(shí)了，大腸桿菌以及麥芽提取物系統(tǒng)都有著較高的合成量，能夠進(jìn)行高通量的蛋白質(zhì)組學(xué)研究。
3.在生物制藥工程中的應(yīng)用
無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)體系長(zhǎng)時(shí)間以來(lái)由于生產(chǎn)效率低下、成本高昂等缺點(diǎn)的限制，在生物學(xué)領(lǐng)域的研究較廣。
隨著生物技術(shù)的進(jìn)步，相關(guān)的能量再生系統(tǒng)以及細(xì)胞提取物制備工藝等近些年來(lái)逐漸得以深入的研究和不斷優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)了蛋白的體外高通量表達(dá)，并有效拓展了無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用領(lǐng)域。
尤其是在生物制藥領(lǐng)域，該系統(tǒng)有著重要的應(yīng)用潛力，為實(shí)現(xiàn)生物制藥諸多問(wèn)題的解決提供了新的解決思路。
以下是筆者根據(jù)自身所學(xué)，總結(jié)出的無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)在生物制藥工程中進(jìn)行重組蛋白藥物的大規(guī)模生產(chǎn)、非天然氨基酸的引入以及蛋白的高通量表達(dá)等方面的具體應(yīng)用。
3.1引入非天然氨基酸
進(jìn)行蛋白工程改性的重要途徑就是將非天然氨基酸引入蛋白序列，以為蛋白質(zhì)進(jìn)行化學(xué)修飾提供額外的基因。
在早期的無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)體系中，通過(guò)加入抑制性tRNA以識(shí)別特定終止密碼子的氨�；�，并以攜帶特定位點(diǎn)無(wú)義突變的基因作為模板，在目標(biāo)蛋白的特定位點(diǎn)引入非天然氨基酸(見(jiàn)圖2)。
相關(guān)的研究人員在此基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)了更為有效的編碼非天然氨基酸技術(shù)，并成功實(shí)現(xiàn)了在蛋白藥物進(jìn)行特異性修飾中的應(yīng)用，賦予了非天然氨基酸以獨(dú)特的藥理特性，如延長(zhǎng)半衰期以及提高了藥代動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性等。
在現(xiàn)階段的研究中，通過(guò)在無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)體系中添加非天然氨基酸底物，建立了高效便捷的反應(yīng)體系，能夠?qū)δ繕?biāo)蛋白進(jìn)行選擇性的修飾。
如國(guó)外研究者Zimmerman等現(xiàn)已研發(fā)出新型的抗腫瘤藥物等。
總之，由于這一方面的優(yōu)勢(shì)，該體系在升級(jí)蛋白藥物領(lǐng)域以及開(kāi)發(fā)新型蛋白藥物中有著廣闊的應(yīng)用前景。
3.2重組蛋白藥物的大規(guī)模生產(chǎn)
隨著相關(guān)科學(xué)家研究的不斷深入和優(yōu)化，近些年來(lái)無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)已日趨成熟，能夠成功開(kāi)發(fā)出反應(yīng)時(shí)間更長(zhǎng)、體積更大且生產(chǎn)效率更高的體外蛋白合成系統(tǒng)。
除此以外，無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)體系的優(yōu)勢(shì)還表現(xiàn)在蛋白活性以及下游純化工藝等方面，推進(jìn)了在重組蛋白藥物生產(chǎn)領(lǐng)域中應(yīng)用該系統(tǒng)的更深層次的研究和發(fā)展。
無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)的常用來(lái)源為大腸桿菌，除此以外對(duì)上述的真核系統(tǒng)為來(lái)源的表達(dá)體系也逐漸被得以進(jìn)一步開(kāi)發(fā)，在更加復(fù)雜結(jié)構(gòu)的膜蛋白以及翻譯后的修飾中得以開(kāi)發(fā)生產(chǎn)。
在這一方面國(guó)外學(xué)者Brodel等有了新的研究進(jìn)展，其建立了一套新型的哺乳動(dòng)物無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)體系，在促進(jìn)蛋白正確折疊、表達(dá)復(fù)雜蛋白方面占據(jù)著優(yōu)勢(shì)地位。
并且在這一系統(tǒng)下，他們已實(shí)現(xiàn)了在體外進(jìn)行人促紅細(xì)胞生成素和螢火蟲(chóng)熒光素酶的成功表達(dá)，并實(shí)現(xiàn)了對(duì)其進(jìn)行糖基化修飾，有著里程碑的研究意義。
其研究結(jié)果也證實(shí)了，無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)在重組蛋白藥物中，有著較好的大規(guī)模生�a的應(yīng)用前景。
3.3蛋白的高通量表達(dá)
實(shí)現(xiàn)基因編碼的蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系以及結(jié)構(gòu)功能的系統(tǒng)闡明，成為后基因組時(shí)代科學(xué)家面臨的重大難題之一。
在這一背景下，建立相對(duì)高效的高通量蛋白表達(dá)技術(shù)就有著十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。
而無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)體系由于其自身獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，在近些年來(lái)的科學(xué)研究中倍受青睞。
較之傳統(tǒng)的體內(nèi)表達(dá)體系，無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)體系省去了對(duì)分子的克隆過(guò)程，可直接使用PCR片段作為模板。
對(duì)于一些很難在體內(nèi)進(jìn)行系統(tǒng)表達(dá)的復(fù)雜蛋白，也能夠?qū)崿F(xiàn)在無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)中的正確折疊。
利用這些優(yōu)勢(shì)，研究人員在進(jìn)行體外蛋白質(zhì)組學(xué)的研究過(guò)程中，就有了一個(gè)更加靈活的研究手段。
除此以外，該系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)還在于能夠進(jìn)行高效便捷的制備蛋白芯片。
利用無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)體系能夠一步法實(shí)現(xiàn)蛋白的固定化，無(wú)需在進(jìn)行大量可溶性蛋白的純化，從而省去了高昂的成本費(fèi)用以及蛋白的表達(dá)與純化過(guò)程，有著較為靈活的過(guò)程和特點(diǎn)。
現(xiàn)階段經(jīng)過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)研究，蛋白芯片技術(shù)已逐漸能夠在臨床診斷以及對(duì)有毒物質(zhì)的檢測(cè)中進(jìn)行有效地應(yīng)用，如對(duì)代謝類(lèi)疾病、癌癥以及免疫的診斷等。
總之，無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)體系在蛋白制備技術(shù)以及高通量蛋白表達(dá)中的成功應(yīng)用和快速發(fā)展，也促進(jìn)了其在新藥發(fā)現(xiàn)、疫苗研發(fā)以及疾病診斷等諸多領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。
綜上所述，作為一種快速高效的體外蛋白合成手段，無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)體系較之傳統(tǒng)的體內(nèi)表達(dá)，能夠有效彌補(bǔ)其不足，實(shí)現(xiàn)了復(fù)雜蛋白在體外的順利表達(dá)，因此在生物制藥領(lǐng)域中有著廣闊的應(yīng)用前景。
當(dāng)然，在現(xiàn)階段的無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)體系中的研究中也仍然存在一定的不足之處，要實(shí)現(xiàn)其在生物制藥工程中更為廣泛的應(yīng)用，還需要相關(guān)的研究人員不斷優(yōu)化和研究其反應(yīng)體系，充分挖掘體外合成系統(tǒng)的應(yīng)用潛力，更好地推進(jìn)我國(guó)生物制藥工程的發(fā)展。
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