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宮頸癌多階段多途徑演進(jìn)的樹模型構(gòu)建論文
目的 基于宮頸癌比較基因組雜交資料構(gòu)建宮頸癌的樹模型，探討宮頸癌發(fā)展演進(jìn)的多途徑模式。 方法 根據(jù)收集的58例宮頸癌完整比較基因組雜交資料，利用Desper等建立的腫瘤樹模型軟件平臺(tái)，構(gòu)建宮頸癌的樹模型。 結(jié)果 宮頸癌樹模型提示，有6個(gè)非隨機(jī)的染色體擴(kuò)增或者缺失事件發(fā)生在宮頸癌變過程中：+1q，+3q，+5p，+17q，+20q和+20p，其中+3q和+1q可能是宮頸癌癌變中的重要早期事件；+3q要先于+17q發(fā)生，并且兩者之間可能存在先后依存關(guān)系；而且，+1q可能是一個(gè)相對(duì)獨(dú)立發(fā)生的事件；這些擴(kuò)增染色體上可能存在與宮頸癌發(fā)生、發(fā)展演進(jìn)密切相關(guān)的瘤基因。結(jié)論 基于比較基因組雜交資料構(gòu)建的宮頸癌樹模型，提示宮頸癌多階段、多途徑的發(fā)展演進(jìn)模式，也為后續(xù)宮頸癌相關(guān)基因的探索指明了方向。Abstract:Objective Based on CGH(comparative genomic hybridization, CGH) data, to construct tree model of cervical carcinoma and to explore multipathway model of cervical carcinoma progression. Methods Using the software which Desper et al developed, tree models of cervical carcinoma were constructed according to the CGH data of 58 cervical carcinoma patients. Results Tree models for cervical carcinoma suggested that there were +1q，+3q，+5p，+17q，+20q and +20p six nonrandom genetic events, and +1q and +3q might be important early events in cervical carcinogenesis, indicating that there might be cancer?related genes in these chromosomal arms. As changes of +3q occurred prior to those of +17q, there might be some cause?effect relationship. The changes of +1q might be a independent genetic event. Conclusion Tree models based on CGH data of cervical carcinoma imply its’ multistep and multipathway progression and direct how to searching for cervical cancer?related genes.
Key words:cervical carcinoma; comparative genomic hybridization;tree model
腫瘤的發(fā)生發(fā)展是基因改變不斷發(fā)生、不斷累積的結(jié)果。那么，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，基因改變的模式如何呢？1988年，Vogelstein等［1］首次提出了結(jié)直腸癌演進(jìn)的經(jīng)典模型，即結(jié)直腸癌的演進(jìn)由4個(gè)遺傳事件以鏈?zhǔn)侥Ｊ桨l(fā)展的，即路徑模型：染色體5q上APC基因的缺失或突變；12p上K?ras基因的突變；18q上DCC基因的缺失；17p上p53基因的缺失或突變。第一個(gè)事件的發(fā)生能增加第二個(gè)事件發(fā)生的概率，第二個(gè)事件的發(fā)生能增加第三個(gè)事件發(fā)生的概率，依次類推。這些基因改變一旦發(fā)生，就是一個(gè)不可逆的發(fā)展演進(jìn)過程。腫瘤演進(jìn)的經(jīng)典路徑模型對(duì)于確定腫瘤早期診斷或治療的相關(guān)基因位點(diǎn)具有重要價(jià)值。于是，人們?cè)噲D在其他腫瘤的演進(jìn)過程中找到與結(jié)直腸癌類似的路徑模型，但是，都沒有成功［2］。事實(shí)上，在腫瘤的發(fā)展演進(jìn)過程中，遺傳物質(zhì)的改變不會(huì)總是按照一定的順序、沿著一條路徑發(fā)生，而且，即使在臨床上或者病理學(xué)上認(rèn)為同質(zhì)的腫瘤，其本身存在異質(zhì)性［3］。因此，探索不依賴于單純線性演進(jìn)的腫瘤發(fā)展模型是很有必要的。Desper等［4,5］提出了反應(yīng)腫瘤異質(zhì)性的腫瘤發(fā)生發(fā)展的兩種進(jìn)化樹模型，即分枝樹和距離樹。為此，本研究利用Desper等基于比較基因組雜交（comparative genomic hybridization,CGH）資料建立的樹模型軟件并加以改進(jìn)，對(duì)58例宮頸癌患者（其中包括4種宮頸癌細(xì)胞株）的CGH資料進(jìn)行了分析，構(gòu)建了宮頸癌發(fā)展演進(jìn)的樹模型。
1 材料與方法
1.1 材料
收集了58例宮頸癌完整CGH檢測(cè)資料，其中FIGO分期Ⅰ期21例，Ⅱ期14例，Ⅲ期16例，Ⅳ期3例，還有4種宮頸癌細(xì)胞株的CGH資料［6-9］。
1.2 事件的選擇
CGH檢測(cè)的結(jié)果是一個(gè)關(guān)于染色體拷貝數(shù)量改變（copy number aberrations,CNAs）的遺傳事件集。本文利用最常用的Brodeur法［10］選擇一組非隨機(jī)事件，Brodeur法假設(shè)擴(kuò)增和丟失的機(jī)會(huì)均等，并與染色體臂長(zhǎng)成正比［11］。構(gòu)建樹模型的數(shù)據(jù)是一系列的染色體擴(kuò)增和丟失，一例病人對(duì)應(yīng)一行數(shù)據(jù)，記錄的是染色體臂水平擴(kuò)增和丟失。人類有22對(duì)常染色體和X、Y兩條性染色體，所有染色體都有長(zhǎng)臂q，而13、14、15、21、22號(hào)染色體短臂p很短，本文排除了這5個(gè)染色體短臂，還忽略了1p、16p、19p、19q和22q這5個(gè)染色體臂，因?yàn)檫@些區(qū)域富含胞嘧啶和鳥嘌呤，易出現(xiàn)假陽性；另外，還忽略了Y染色體，因?yàn)槠涠糖液苌俑淖儭＿@樣就剩下36條染色體臂需要分析，而每條染色體臂都有可能擴(kuò)增或丟失，因此，總共有72個(gè)可能事件。
1.3 樹模型
1.3.1 分枝樹（branching trees）
Desper等人［4］利用基于計(jì)算機(jī)技術(shù)的最大權(quán)重分枝方法提出的一種重構(gòu)腫瘤發(fā)生發(fā)展的樹模型方法，并稱這種樹模型為分枝樹。該模型把一個(gè)節(jié)點(diǎn)作為根（root），而其他的每個(gè)節(jié)點(diǎn)都代表一個(gè)遺傳事件。在一個(gè)樹枝上，i>j表示一種假說的因果關(guān)系，即事件i的出現(xiàn)使得事件j的發(fā)生更為可能。分枝樹實(shí)際上是Vogelstein路徑模型的泛化，也就是將腫瘤發(fā)生的一條路徑模型轉(zhuǎn)化為多條路徑模型（multiple pathways），一個(gè)樹干即為一條路徑，更直觀地體現(xiàn)了腫瘤的異質(zhì)性。分枝樹提示：（1）靠近樹根的事件可能是早期事件，也可能是因?yàn)榕c其他事件的發(fā)生相關(guān)性不大而置于近根部；（2）在一個(gè)樹枝（edge）上按順序走向的事件有可能存在因果關(guān)系；（3）集聚在樹的分枝（subtree）下的事件可以作為腫瘤亞型（subclass）的標(biāo)志。
1.3.2 距離樹（distance?based trees）
Desper等人［5］利用現(xiàn)有的系統(tǒng)發(fā)育算法建立另一種樹模型。該模型把所有的事件都作為葉子，同時(shí)把隱含的、未命名的事件作為內(nèi)在節(jié)點(diǎn)。該模型的另一個(gè)不同點(diǎn)是，樹中的每一個(gè)樹枝都有長(zhǎng)度，因此，基于這種方法建立的樹模型被稱作距離樹。從根到其他事件i的距離為?log (pi), 其中pi是事件i的觀察概率，可見，事件i的觀察概率越大，它離樹根的距離越近，即越早發(fā)生。距離樹提示：（1）靠近根的事件是早期事件；（2）集聚在樹的分枝（subtree）下的事件可以作為腫瘤的亞型（subclass）標(biāo)志。
1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
用SPSS10.0 for windows統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行χ2檢驗(yàn)， 當(dāng)n<40 或頻數(shù)<1 時(shí)，用確切概率法。
2 結(jié) 果
2.1 宮頸癌發(fā)展演進(jìn)樹模型的構(gòu)建
宮頸癌樹模型見圖1。從分枝樹模型可以看出，+1q和+3q可能是宮頸癌癌變較早期事件，+1q是相對(duì)較獨(dú)立的事件，+3q的出現(xiàn)可能導(dǎo)致+17q的發(fā)生，而+17q的發(fā)生又將促進(jìn)+20q的發(fā)生，+20q的發(fā)生必將增加+5p、+20p出現(xiàn)的概率。從距離樹可以清楚地得出+3q是宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程中較重要的早期事件。
2.2 宮頸癌中非隨機(jī)染色體事件的統(tǒng)計(jì)分析
58例宮頸癌（其中4個(gè)細(xì)胞株）樣本中，+1q，+3q，+5p，+17q，+20q和+20p分布見表2，各染色體臂改變的頻率如下：+1q為36.2%；+3q為70.7%；+5p為20.0%；+17q為24.1%；+20q為15.5%；+20p為15.5%。表1 宮頸癌6個(gè)非隨機(jī)染色體事件分布情況（略）
2.3 根據(jù)宮頸癌樹模型可以看出，宮頸癌可能存在2種亞型：一種以+3q、+5p、+17q、+20p和+20q為標(biāo)記，一種以+1q為標(biāo)記；宮頸癌染色體改變以擴(kuò)增為主。
3 討 論
自從1988年Vogelstein 等［1］提出結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展、演進(jìn)的經(jīng)典路徑模型，科學(xué)研究者們希望其他腫瘤的發(fā)展演進(jìn)也有與結(jié)直腸癌相似的經(jīng)典路徑模式，但是都沒有取得理想的結(jié)果。原因是腫瘤是一個(gè)多因素參與、多基因改變、多步驟發(fā)展的復(fù)雜過程，腫瘤具有異質(zhì)性。
比較基因組雜交技術(shù)可以在染色體或染色體亞區(qū)水平上對(duì)DNA序列拷貝數(shù)進(jìn)行檢測(cè)、定位。它最大的優(yōu)點(diǎn)是一次雜交就可以全面檢測(cè)出腫瘤基因組復(fù)雜的遺傳改變，包括染色體區(qū)段拷貝數(shù)的增加或減少。為了深入挖掘從大量標(biāo)本獲得的海量CGH資料中蘊(yùn)含的關(guān)于腫瘤發(fā)生、發(fā)展、演進(jìn)的規(guī)律，Desper等根據(jù)數(shù)學(xué)原理結(jié)合計(jì)算機(jī)技術(shù)開發(fā)出了一種CGH資料數(shù)據(jù)分析軟件，即根據(jù)CGH資料數(shù)據(jù)構(gòu)建腫瘤發(fā)生、發(fā)展、演進(jìn)的2種樹模型：分枝樹和距離數(shù)。他們利用CGH資料數(shù)據(jù)分析軟件分析了116例腎透明細(xì)胞癌的CGH資料，并構(gòu)建了腎透明細(xì)胞癌的2種樹模型，結(jié)果分析與以前細(xì)胞遺傳學(xué)研究的結(jié)果相吻合，如3p丟失是腎透明細(xì)胞癌發(fā)生的早期事件，根據(jù)樹模型還提出了腎透明細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展過程中有意義的新假說［12］。這有力地說明構(gòu)建基于CGH資料的腫瘤樹模型對(duì)于研究腫瘤發(fā)生發(fā)展及其演進(jìn)規(guī)律是非常有意義的。
尹志華［13］等利用CGH資料數(shù)據(jù)分析軟件分析了收集到的127例結(jié)直腸癌的CGH資料，構(gòu)建了結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的樹模型，結(jié)果顯示，樹模型與Vogelstein的經(jīng)典路徑模型有一定的吻合度，如-18q先于-17p發(fā)生，而且使后者的發(fā)生可能性更大。兩者差別也是明顯的，與經(jīng)典路徑模型相比，樹模型更體現(xiàn)了腫瘤的異質(zhì)性及腫瘤發(fā)生發(fā)展的多途徑模式，更符合現(xiàn)代關(guān)于腫瘤發(fā)生發(fā)展演進(jìn)的理論，經(jīng)典路徑模型顯得過于簡(jiǎn)單。
本研究利用CGH資料數(shù)據(jù)分析軟件分析了58例宮頸癌CGH資料，構(gòu)建了宮頸癌發(fā)生發(fā)展的樹模型，模型各染色體臂改變的頻率如下：+1q為36.2%；+3q為70.7%；+5p為20.0%；+17q為24.1%；+20q為15.5%；+20p為15.5%。Lazo等［14］研究發(fā)現(xiàn)，90%的浸潤(rùn)宮頸癌中發(fā)現(xiàn)有3q的擴(kuò)增。Wilting等［15］研究發(fā)現(xiàn)，在宮頸鱗狀細(xì)胞癌和宮頸腺癌中常見20q拷貝數(shù)的擴(kuò)增。樹模型提示，+1q和+3q可能是宮頸癌癌變較早期事件，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果也證明了這一點(diǎn)，+1q 、+3q和+17q在宮頸癌的發(fā)展演進(jìn)過程的各個(gè)階段中差異沒有顯著性（P＞0.05）。
Andersson等［16］研究發(fā)現(xiàn)，宮頸腺癌中，3q26上人端粒酶基因TERC常見擴(kuò)增，并可作為宮頸腺癌的診斷指標(biāo)。+5p和+20p在宮頸癌早期和進(jìn)展期中，差異有顯著性（P＜0.05），進(jìn)展期高于早期，說明+5p和+20p 是宮頸癌發(fā)展演進(jìn)的晚期事件，+20q 在宮頸癌發(fā)展演進(jìn)中的確切作用有待擴(kuò)大樣本進(jìn)一步確定。根據(jù)樹模型可以推測(cè)，宮頸癌可能存在2種亞型：一種以+3q、+5p、+17q、+20p和+20q為標(biāo)記，一種以+1q為標(biāo)記；宮頸癌染色體改變以擴(kuò)增為主。
總之，利用CGH資料數(shù)據(jù)分析軟件構(gòu)建基于CGH資料的腫瘤發(fā)生發(fā)展的樹模型，對(duì)于挖掘蘊(yùn)含在海量數(shù)據(jù)中的腫瘤發(fā)生發(fā)展演進(jìn)規(guī)律具有重要意義。本研究提示+1q 、+3q、 +5p、+17q、+20p和+20q是宮頸癌發(fā)生發(fā)展演進(jìn)過程中的非隨機(jī)事件，提示在這些染色體臂上可能存在與宮頸癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的腫瘤基因，為后續(xù)相關(guān)研究指明了方向。
由于CGH技術(shù)存在敏感性低的缺點(diǎn)，小于10 Mb的染色體改變檢測(cè)不出［17］ ，一些染色體缺失11q23，2p, 3p, 18q21.3 和11p15.5等未出現(xiàn)在樹模型中［18，19］。 但是，一次實(shí)驗(yàn)就能給出了一個(gè)腫瘤全基因組水平的遺傳改變的全貌�；贑GH資料和數(shù)學(xué)模擬建立的腫瘤發(fā)生發(fā)展的進(jìn)化樹模型，科學(xué)地闡明了腫瘤發(fā)生發(fā)展的多基因、多步驟的演進(jìn)過程，體現(xiàn)了腫瘤內(nèi)在的異質(zhì)性。深入分析宮頸癌進(jìn)化樹模型中的6個(gè)非隨機(jī)染色體事件，對(duì)于發(fā)現(xiàn)與宮頸癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的腫瘤相關(guān)基因，闡明宮頸癌發(fā)病的分子機(jī)制等具有重要指導(dǎo)意義。
致謝：衷心感謝美國國立健康研究所（NIH）的Desper R和Schaffer A為本分析CGH資料所提供的熱情幫助。
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