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原發(fā)性支氣管肺癌中PTEN基因的蛋白表達(dá)及意義論文
目的 研究抑癌基因PTEN在原發(fā)性肺癌中的蛋白表達(dá)及其臨床意義。方法 應(yīng)用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)56例手術(shù)切除的肺癌石蠟標(biāo)本及3例正常肺組織中的PTEN基因的蛋白表達(dá)情況。結(jié)果 ①正常肺組織中PTEN蛋白表達(dá)的陽(yáng)性率明顯高于肺癌患者，而在小細(xì)胞肺癌中的陽(yáng)性表達(dá)低于非小細(xì)胞肺癌；②在56例肺癌患者中，隨著分化程度的降低，PTEN的蛋白陽(yáng)性表達(dá)率也隨之下降；③Ⅰ、Ⅱ期肺癌患者的PTEN蛋白陽(yáng)性表達(dá)率高于Ⅲ、Ⅳ期患者；④在19例有轉(zhuǎn)移的肺癌患者中，PTEN表達(dá)陽(yáng)性率明顯低于無(wú)轉(zhuǎn)移的患者。結(jié)論 PTEN基因的表達(dá)與肺癌的病理類型、組織的分化程度、臨床分期以及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。ABSTRACT: Objective To study the protein expression level and clinicalsignificance of the tumor suppressor gene PTEN in primary lung cancer. Methods We detected the protein expression of PTEN gene in paraffin specimens of 56 cases of lung cancer and 3 specimens of normal lung tissues by SPimmunohistochemistry. Results ① The positive rate of PTEN protein expression was higher in normal lung tissues than in lung cancer specimens, while it was lower in SCLC than in NSCLC. ② The positive rate of expression of PTEN protein became lower as the differentiation level decreased in the 56 cases of lung cancer specimens. ③ The positive rate of expression of PTEN protein was higher in patients with lung cancer of stage Ⅰ and Ⅱ than that in stage Ⅲ and Ⅳ. ④ The positive rate of expression of PTEN protein was 26.32% in 19 cases of transfused specimens, which was obviously lower than that in non-transfused specimens. Conclusion The expression of PTEN gene is related to classification criteria of lung cancer, malignancy degree, clinical stage and lymph node transfusion.
KEY WORDS: lung cancer; phosphatase and tensin homologue deleted from chromosome 10 gene(PTEN); immunohistochemistry
腫瘤的發(fā)生是多階段、多步驟和多基因改變的過程，腫瘤的惡性表型是多種因素相互作用導(dǎo)致正常細(xì)胞惡變的結(jié)果，而癌基因的激活和抑癌基因的失活在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。對(duì)抑癌基因的研究不僅在探索腫瘤發(fā)生的分子生物學(xué)機(jī)制方面有重要意義，而且在腫瘤的預(yù)防、治療、誘導(dǎo)分化、凋亡、衰老等方面也有重大價(jià)值。PTEN基因(phosphatase and tensin homologue deleted from chromosome 10 gene)又稱MMAC1(mutated in multiple advanced cancers gene)或TEP1(TGF-regulated and epithelial phosphatase 1 gene)，是1997年由Steck等［1］3個(gè)研究小組分別發(fā)現(xiàn)并命名的一種新的抑癌基因(簡(jiǎn)稱PTEN)�，F(xiàn)已證實(shí)該基因的突變、失活與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。為探討原發(fā)性支氣管肺癌中PTEN基因的蛋白表達(dá)與肺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，我們用免疫組織化學(xué)方法對(duì)56例肺癌患者石蠟標(biāo)本及3例正常肺組織標(biāo)本進(jìn)行了研究。
1 材料與方法
1.1 材料
所有標(biāo)本均取自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院病理科2001年至2004年間石蠟包埋標(biāo)本，56例經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí)為原發(fā)性肺癌。其中男性39例，女性17例；年齡36-75歲，平均55歲。所有患者術(shù)前均未接受化療、放療及免疫治療。根據(jù)WHO(1981)肺癌的分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行組織學(xué)分類，根據(jù)腫瘤的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)(組織結(jié)構(gòu)、異型性等)進(jìn)行病理分級(jí)。其中鱗癌23例、腺癌20例、小細(xì)胞肺癌13例；病理分級(jí)為分化良好的17例、中等分化24例、分化不良15例。TNM分期按UICC(1997)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行：Ⅰ期12例、Ⅱ期18例、Ⅲ期15例、Ⅳ期11例。肺門和(或)縱隔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(簡(jiǎn)稱轉(zhuǎn)移)：有轉(zhuǎn)移19例、無(wú)轉(zhuǎn)移37例。3例正常肺組織為對(duì)照，來(lái)自手術(shù)切除的癌旁正常肺組織(至少距離癌腫5 cm以上)。
1.2 方法
采用免疫組化SP法。鼠抗人PTEN單克隆抗體及SP試劑盒均購(gòu)于北京中山生物公司。標(biāo)本經(jīng)甲醛溶液固定，石蠟包埋，連續(xù)切片3張，厚5 μm，常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)染色復(fù)查診斷。免疫組化檢測(cè)步驟：一抗稀釋濃度1∶50，常規(guī)脫蠟后微波爐抗原修復(fù)，4 ℃過夜，PBS洗；二抗37 ℃ 30 min，PBS洗；加鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶溶液，37 ℃ 30 min，PBS洗；DAB顯色，蘇木素復(fù)染。用已知陽(yáng)性切片作陽(yáng)性對(duì)照，PBS代替一抗作陰性對(duì)照。
1.3 結(jié)果判定
參照Fromowitz等的方法［2］。首先按染色強(qiáng)度評(píng)分：0分為無(wú)色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色；再按陽(yáng)性細(xì)胞所占的百分比評(píng)分：0分為陰性，1分為陽(yáng)性細(xì)胞≤10%，2分為11%-50%，3分為51%-75%，4分為＞75%。染色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞百分比的分值乘積>3分為免疫組化反應(yīng)陽(yáng)性。
1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
應(yīng)用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，計(jì)數(shù)資料組間的比較均采用卡方檢驗(yàn)，P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2 結(jié)果
2.1 PTEN蛋白在肺癌組織中的定位
陽(yáng)性染色主要位于癌細(xì)胞質(zhì)(膜)，癌細(xì)胞核也有部分表達(dá)；陽(yáng)性產(chǎn)物呈棕黃色彌漫分布(圖1)。
2.2 PTEN蛋白表達(dá)與肺癌一般臨床特征的關(guān)系
PTEN在56例肺癌患者中的表達(dá)陽(yáng)性率為37.50%，其中PTEN表達(dá)陽(yáng)性的患者平均年齡為(53.35±8.70)歲，表達(dá)陰性的患者平均年齡為(54.90±9.25)歲，兩者相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；39例男性患者中PTEN陽(yáng)性表達(dá)率為41.03%，17例女患者中為29.14%，兩者相比亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
2.3 PTEN蛋白表達(dá)與肺癌病理類型的關(guān)系
56例肺癌患者PTEN蛋白表達(dá)的陽(yáng)性率為50.00%，其中23例鱗癌中的陽(yáng)性率為60.87%，20例腺癌中的陽(yáng)性率為55.00%，兩者比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；13例小細(xì)胞癌中的陽(yáng)性表達(dá)率為23.08%，其PTEN陽(yáng)性率明顯低于前兩者，且具有顯著性差異(P<0.05)。說(shuō)明PTEN在小細(xì)胞肺癌中的陽(yáng)性表達(dá)低于非小細(xì)胞肺癌，提示PTEN的蛋白表達(dá)與肺癌的病理類型有關(guān)。
2.4 PTEN蛋白表達(dá)與肺癌分化程度的關(guān)系
在56例肺癌患者中，隨著分化程度的降低，PTEN的蛋白表達(dá)陽(yáng)性率也隨之下降，分化良好者較中等分化者PTEN表達(dá)陽(yáng)性率為高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而分化不良者與前兩者相比PTEN蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯降低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。表1 PTEN蛋白表達(dá)與肺癌分化程度的關(guān)系（略）
2.5 PTEN蛋白表達(dá)與肺癌臨床分期及轉(zhuǎn)移的關(guān)系
�、瘛ⅱ蚱诨颊叩腜TEN蛋白陽(yáng)性表達(dá)率相近，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Ⅲ、Ⅳ期患者的PTEN蛋白表達(dá)陽(yáng)性率明顯降低，與Ⅰ、Ⅱ期相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示隨著病變的進(jìn)展，PTEN的表達(dá)率呈下降趨勢(shì)。在19例有轉(zhuǎn)移的患者中，PTEN表達(dá)陽(yáng)性率為26.32%，明顯低于無(wú)轉(zhuǎn)移者，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩者之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表2)。表2 PTEN的蛋白表達(dá)與肺癌臨床分期及轉(zhuǎn)移的關(guān)系（略）
3 討論
PTEN是一種多功能的磷酸酯酶，主要有以下功能［3］：①參與胚胎的正常發(fā)育［4］； ②通過G1期阻滯或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡機(jī)制，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)；③抑制端粒酶的活性；④抑制細(xì)胞的遷移、鋪展和局部黏附。許多研究顯示，PTEN基因的缺失、突變或表達(dá)產(chǎn)物的失活，影響肺癌的發(fā)生、發(fā)展。Kohno等［5］檢測(cè)了40株肺癌細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)15株小細(xì)胞肺癌中6株發(fā)生了PTEN DNA純合性丟失，25株非小細(xì)胞肺癌中2株發(fā)生了PTEN DNA純合性丟失，2株有無(wú)活性突變和錯(cuò)義突變，小細(xì)胞肺癌的PTEN失表達(dá)率似乎高于非小細(xì)胞肺癌，說(shuō)明PTEN在肺癌的發(fā)生、發(fā)展中作為一個(gè)抑癌基因發(fā)揮作用。且有研究顯示，PTEN蛋白表達(dá)水平的高低與患者的病理分級(jí)及預(yù)后有關(guān)，患者預(yù)后越差，惡性度越高，PTEN蛋白水平越低。提示PTEN可能參與了肺癌的發(fā)生、發(fā)展及浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。
本研究結(jié)果顯示，肺癌組織中PTEN基因的蛋白表達(dá)主要分布于癌細(xì)胞質(zhì)，核膜上也有著色，而且正常肺組織較肺癌組織著色明顯增強(qiáng)。這與Hager等［6］對(duì)腎細(xì)胞癌的相關(guān)研究相似。盡管不同年齡、性別患者的PTEN基因的蛋白表達(dá)不同，但差異甚微，提示PTEN基因的表達(dá)與患者的年齡、性別無(wú)關(guān)。實(shí)驗(yàn)中，肺癌組織PTEN基因的蛋白表達(dá)陽(yáng)性率為50%，正常肺組織PTEN基因的蛋白表達(dá)陽(yáng)性率為93.27%，肺癌組織PTEN基因的蛋白表達(dá)顯著低于正常肺組織，認(rèn)為原發(fā)性支氣管肺癌中PTEN基因的蛋白表達(dá)下調(diào)，提示PTEN基因的蛋白表達(dá)缺失在肺癌的發(fā)生中可能起重要作用。但Hosoya等［7］報(bào)道PTEN基因的突變率只有13.30%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到的PTEN基因的蛋白表達(dá)缺失率(由陽(yáng)性率計(jì)算)50%。其原因可能是：①影響PTEN基因的蛋白表達(dá)的因素很多，如PTEN基因的純和性丟失或突變、PTEN基因的雜合性丟失、PTEN基因啟動(dòng)子的甲基化、非翻譯區(qū)的微小病變等均可導(dǎo)致該基因的低表達(dá)或不表達(dá)；②在PTEN基因復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯以及翻譯后修飾的水平也可發(fā)生PTEN基因的低表達(dá)或不表達(dá)。
目前的一些研究結(jié)果提示，PTEN基因的變異與肺癌的不同病理類型有關(guān)［8-9］。Zhang等［10］研究顯示，PTEN在小細(xì)胞肺癌中的缺失率達(dá)44%，高于非小細(xì)胞肺癌(24%)，提示PTEN的缺失在肺癌，尤其是小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展中起一定作用。本研究顯示PTEN基因蛋白表達(dá)在非小細(xì)胞肺癌中的陽(yáng)性率明顯高于小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)陽(yáng)性率(鱗癌60.87%、腺癌55.00%、小細(xì)胞癌23.08%)，說(shuō)明PTEN基因的表達(dá)與腫瘤的組織類型密切相關(guān)，尤其在小細(xì)胞肺癌中可能發(fā)揮重要作用。
關(guān)于PTEN基因與肺癌病理分級(jí)，臨床分期的關(guān)系，國(guó)內(nèi)外報(bào)道不多。Sano等［11］研究發(fā)現(xiàn)PTEN基因表達(dá)水平的高低與神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的病理分級(jí)相關(guān)，PTEN基因表達(dá)水平越低，說(shuō)明腫瘤的惡性程度越高，臨床分期越晚，預(yù)后也就越差。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示分化不良的肺癌PTEN基因的蛋白表達(dá)陽(yáng)性率低于分化良好和中等分化者，且臨床分期越晚，PTEN基因的蛋白陽(yáng)性表達(dá)率也越低，提示PTEN基因表達(dá)與腫瘤的惡性程度、臨床分期密切相關(guān)，表達(dá)水平越低，臨床分期越晚，腫瘤的惡性程度越高。
Salvesen等［12］報(bào)道子宮內(nèi)膜癌PTEN啟動(dòng)子甲基化患者很容易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。本實(shí)驗(yàn)也顯示有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌患者PTEN基因的蛋白表達(dá)明顯低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，提示PTEN基因的低表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，表達(dá)陽(yáng)性率越低，越容易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。這可能是因?yàn)镻TEN基因低表達(dá)的肺癌患者失去了PTEN對(duì)FAK介導(dǎo)的細(xì)胞浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移和生長(zhǎng)的抑制作用，從而發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。
PTEN基因的蛋白在肺癌組織中的表達(dá)較正常肺組織中的表達(dá)有所降低，說(shuō)明PTEN基因的低表達(dá)可能在肺癌的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。該基因的表達(dá)與肺癌患者的年齡、性別無(wú)關(guān)，而與肺癌的病理類型、組織的分化程度、臨床分期、以及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，表明PTEN基因可能作為判斷肺癌病情嚴(yán)重程度及預(yù)后的指標(biāo)，也可作為基因治療的靶基因。這為今后肺癌的診斷及治療提供新的思路。
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