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灰黃霉素提取技術(shù)
灰黃霉素提取技術(shù)
【摘要】目的 探討超聲波提取灰黃霉素的優(yōu)化工藝條件。
方法 用紫外分光光度法(UV)測(cè)定灰黃霉素的含量。
以灰黃霉素的提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，在單一影響因素考察的基礎(chǔ)上，采用正交實(shí)驗(yàn)確定超聲波提取灰黃霉素的優(yōu)化工藝條件。
結(jié)果 超聲波提取灰黃霉素的優(yōu)化工藝條件為：10倍量的丙酮為提取溶劑，功率300W，單次輻射時(shí)間3s，間歇時(shí)間5s，提取時(shí)間40min，灰黃霉素提取率為85.58%。
通過(guò)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明，本實(shí)驗(yàn)所得工藝條件為優(yōu)化工藝條件。
結(jié)論 本實(shí)驗(yàn)所得工藝條件可行，具有一定的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
【主題詞】 灰黃霉素 提取 技術(shù)
灰黃霉素(griseofulvin)是1939年從灰黃青霉(Penicillium griseofulvin)培養(yǎng)液中得到的一種含氯代謝產(chǎn)物，1958年開(kāi)始用于臨床。
1960年中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院抗生素研究所從我國(guó)土壤中得到灰黃霉素的生產(chǎn)菌，并研究試制成功灰黃霉素。
灰黃霉素是非多烯類(lèi)抗真菌抗生素，已廣泛用于治療皮膚及角質(zhì)層的真菌感染。
對(duì)紅色發(fā)癬菌、斷發(fā)癬菌、硫毛發(fā)癬菌、小孢子菌和絮狀表皮菌等有抑制作用。
臨床用于頭癬、迭瓦癬、皮膚癬及手(足，甲)癬等體表真菌感染，特別對(duì)頭癬的療效顯著，國(guó)內(nèi)治愈率在90%以上。
灰黃霉素是存在于菌絲體內(nèi)部的抗生素。
目前工業(yè)上采用溶劑連續(xù)浸泡干菌體的提取方法，溶劑大多為丙酮。
考慮到常規(guī)提取所需時(shí)間較長(zhǎng)，提取率較低，溶劑用量較大，本研究探討采用超聲波技術(shù)提取灰黃霉素的工藝，利用超聲波的空化作用、熱效應(yīng)、機(jī)械作用破壞菌體細(xì)胞壁，使溶劑易于滲透至細(xì)胞內(nèi)，有效成分更多的轉(zhuǎn)移到溶劑中，達(dá)到縮短提取時(shí)間，提高提取率的目的。
一 儀器與材料
1 儀器： U�1810型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器公司)，ALC210.4型電子天平(德國(guó)Sartorius公司)，JY92�2D超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)，HF�2.5B超聲波循環(huán)提取器(北京宏祥隆生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司)。
2 材料： 灰黃霉素菌體(赤峰制藥集團(tuán)生產(chǎn)，編號(hào)：NI�88)，對(duì)照品(中華制藥廠產(chǎn)品，純度為99.8%)，丙酮(天津市博迪化工有限公司)，95%乙醇(沈陽(yáng)化學(xué)試劑廠)，氯仿(天津市博迪化工有限公司)，所用試劑均為分析純。
二 實(shí)驗(yàn)方法
1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備： 精密稱(chēng)取灰黃霉素對(duì)照品25mg，25ml丙酮溶液定容，配制標(biāo)準(zhǔn)溶液(初始濃度1.0mg/ml)。
精密量取標(biāo)準(zhǔn)溶液2ml于25ml容量瓶，用95%乙醇定容。
取丙酮2ml置于25ml容量瓶中，95%乙醇定容，作為空白溶液。
紫外光譜200～400nm全波長(zhǎng)掃描，在326nm處有最大吸收峰。
2 灰黃霉素含量測(cè)定： 稱(chēng)取灰黃霉素菌體(含水<5%)1.0g置于250ml燒瓶中，加入丙酮50ml，磁力攪拌回流提取三次，每次1h。
測(cè)得菌體中灰黃霉素含量為30.67%。
3 灰黃霉素超聲波提取影響因素考查： (1)超聲提取溶劑 文獻(xiàn)報(bào)道灰黃霉素易溶于二甲基甲酰胺、二氯乙烷(以上溶解度約為10%～12%w/v)，可溶于丙酮、氯仿、乙醇(在丙酮中溶解度為5.0%，氯仿為4.4%，乙醇為1.66%)，不溶于水和石油醚。
考慮到二甲基甲酰胺價(jià)格較高，二氯乙烷毒性較大，本實(shí)驗(yàn)主要選取丙酮、氯仿及95%乙醇為超聲提取溶劑。
稱(chēng)取灰黃霉素菌體5g，共3份，分別用丙酮、氯仿、95%乙醇50ml溶解，超聲條件設(shè)定為：功率400W，單次輻射時(shí)間3s，提取時(shí)間40min，室溫下進(jìn)行提取，分別測(cè)定灰黃霉素溶液的吸光度，提取率分別為83.71%、78.69%和28.95%。
由于丙酮對(duì)灰黃霉素的提取率較高，因此本實(shí)驗(yàn)選取丙酮作為超聲提取溶劑。
(2)溶劑用量 稱(chēng)取灰黃霉素菌體5g，共6份，分別用4、8、10、12、16、20倍量丙酮溶解，超聲波條件不變。
分別測(cè)定灰黃霉素溶液的吸光度，計(jì)算提取率。
溶劑4倍量時(shí)，提取液中結(jié)晶析出太多，故舍去該實(shí)驗(yàn)點(diǎn)。
如Fig.1所示，在溶劑倍量為16時(shí)有最大提取率。
考慮到用較少的溶劑得到較高的提取率，本實(shí)驗(yàn)確定溶劑倍量為10。
(3)超聲波提取功率 稱(chēng)取灰黃霉素菌體5g，共3份，分別用丙酮50ml溶解，超聲波條件設(shè)定為：功率分別為200、300和400W，單次輻射時(shí)間3s，提取時(shí)間40min，室溫下進(jìn)行提取。
分別測(cè)定灰黃霉素溶液的吸光度，計(jì)算提取率。
如Fig.2所示，在超聲功率為300W時(shí)有最大提取率。
(4)超聲波提取時(shí)間 稱(chēng)取灰黃霉素菌體5g，用丙酮50ml溶解，超聲波條件設(shè)定為：功率400W，單次輻射時(shí)間3s，間歇時(shí)間5s，室溫下進(jìn)行提取。
從提取時(shí)間20min開(kāi)始，每10min取樣一次，測(cè)定灰黃霉素溶液的吸光度，計(jì)算提取率。
如Fig.3所示，在提取時(shí)間為40min時(shí)有最大提取率。
4 正交實(shí)驗(yàn)： 在單一影響因素考察的基礎(chǔ)上，確定以10倍量丙酮為提取溶劑，選取超聲波功率、單次輻射時(shí)間、提取時(shí)間作為考察指標(biāo)，采用四因素三水平L9(34)的正交試驗(yàn)對(duì)灰黃霉素的超聲波提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。
根據(jù)K值確定灰黃霉素超聲波提取的優(yōu)化工藝條件為：功率300W，單次輻射時(shí)間3s，提取時(shí)間40min。
根據(jù)R值判斷，各因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響大小順序?yàn)锽>A>C。
5 優(yōu)化工藝的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)： 按優(yōu)化工藝條件重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果灰黃霉素的收率平均值為85.58%，表明實(shí)驗(yàn)所確定的工藝條件為優(yōu)化工藝條件。
6 超聲波循環(huán)提取實(shí)驗(yàn)： 超聲波循環(huán)提取器中加入丙酮2200ml(10倍)，開(kāi)啟攪拌轉(zhuǎn)子，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為1000r/min。
緩慢加入菌體220g，待料液完全循環(huán)后，開(kāi)啟超聲波發(fā)射器，按正交實(shí)驗(yàn)確定的優(yōu)化工藝條件(功率300W，單次輻射時(shí)間3s，提取時(shí)間40min)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，所得提取率為87.65%，略高于驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)所得提取率。
循環(huán)放大實(shí)驗(yàn)表明該優(yōu)化工藝條件可應(yīng)用于灰黃霉素提取。
三 結(jié)論
本研究通過(guò)正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，對(duì)灰黃霉素的超聲波提取工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化。
確定了超聲波提取灰黃霉素的優(yōu)化工藝條件為：10倍量的丙酮為提取溶劑，功率300W，單次輻射時(shí)間3s，提取時(shí)間40min。
驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)所得提取率為85.58%，超聲波循環(huán)放大提取實(shí)驗(yàn)所得提取率為87.65%，表明了該優(yōu)化工藝條件應(yīng)用于灰黃霉素的提取是可行的。
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