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正常絨毛和葡萄胎中Mel-CAM標(biāo)記中間型滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖情況論文
目的 探討葡萄胎中Mel-CAM與滋養(yǎng)細(xì)胞黏附、浸潤(rùn)之間的關(guān)系以及Mel-CAM標(biāo)記中間型滋養(yǎng)細(xì)胞(IT)的增殖情況。方法 采用雙重免疫組化法，檢測(cè)Mel-CAM標(biāo)記IT的Ki-67表達(dá)情況。結(jié)果 葡萄胎中Mel-CAM表達(dá)較正常絨毛明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；葡萄胎絨毛表面有Mel-CAM標(biāo)記IT出現(xiàn)，而正常絨毛表面則無；葡萄胎組織中IT的Ki-67指數(shù)較正常絨毛明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 葡萄胎絨毛表面有Mel-CAM表達(dá)，表現(xiàn)出雙重分化方向，這可能與葡萄胎的發(fā)病機(jī)制有關(guān)；檢測(cè)葡萄胎組織中IT的Ki-67指數(shù)對(duì)于預(yù)測(cè)葡萄胎的轉(zhuǎn)歸有潛在的價(jià)值。ABSTRACT: Objective To explore the relationship between Mel-CAM and adherence and invasion of trophoblastic cells and proliferation of Mel-CAM defined intermediate trophoblast. Methods Double immunohistochemical staining technique was used to detect the expression of Ki-67 in Mel-CAM defined intermediate trophoblast in human villi during the first trimester and hydatidiform mole. Results In this study there was a significantly stronger expression of Mel-CAM in hydatidiform mole than that in first-trimester villi (P<0.05). The expression of Mel-CAM in hydatidiform mole was observed on the surface of villi, but not in human villi. The Ki-67 index of hydatidiform mole was higher than that it of human villi with a significant difference (P<0.05). Conclusion Mel-CAM might play an important role in the invasion of trophoblastic cells. The different differentiation type of villous trophoblast in hydatidiform mole and the first-trimester villi may be correlated with pathogenesis. The Ki-67 index of intermediate trophoblast has a potential value in predicting prognosis of hydatidiform mole.
KEY WORDS: melanoma cell adhesion molecule; intermediate trophoblast; Ki-67; hydatidiform mole
中間型滋養(yǎng)細(xì)胞(intermediate trophoblast, IT)是正常胎盤和妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病(gestational trophoblastic disease, GTD)中一類特殊的滋養(yǎng)細(xì)胞類型。隨著研究的深入，逐漸認(rèn)識(shí)到IT是一類獨(dú)立的細(xì)胞類型，有自身特殊的免疫組織化學(xué)和生物學(xué)特征，并且IT的獨(dú)立增生可以形成胎盤部位滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤(placental site trophoblastic tumor, PSTT)、超常胎盤部位(exaggerated placental site, EPS)、胎盤部位結(jié)節(jié)(placental site nodule, PSN)和上皮樣滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤(epithelioid trophoblastic tumor, ETT)等多種良、惡性疾病。但是，由于IT的細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征介于合體滋養(yǎng)細(xì)胞(syncytiotrophoblast, ST)和細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞(cytotrophoblast, CT)之間，給研究工作帶來了極大的困難。隨著IT的特異性標(biāo)記物Mel-CAM的發(fā)現(xiàn)，使得IT的研究跨入了一個(gè)新的階段。因此，本研究中利用Mel-CAM標(biāo)記IT，研究其在正常絨毛和葡萄胎中的增殖情況，以期對(duì)IT與疾病的關(guān)系有更進(jìn)一步的了解。
1 對(duì)象與方法
1.1 研究對(duì)象
選擇1995年1月至2000年12月間西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院的葡萄胎(hydatidiform mole, HM)組織標(biāo)本30例作為研究組，患者年齡22-50歲，平均32歲。選擇2000年門診正常早期妊娠(6-12周)人流術(shù)后絨毛組織標(biāo)本20例作為對(duì)照組。
1.2 主要試劑
鼠抗人Mel-CAM及Ki-67單克隆抗體均為北京中山金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。
1.3 標(biāo)本的制備及免疫組化染色
取上述葡萄胎患者首次清宮組織標(biāo)本及正常早期妊娠絨毛組織標(biāo)本，多聚甲醛固定，石蠟包埋，常規(guī)切片，切片厚5 μm。用雙重免疫組化的方法先進(jìn)行Ki-67的染色，DAB顯色；然后做Mel-CAM染色，AEC顯色。陰性對(duì)照：用相鄰切片對(duì)照染色，以PBS代替第一抗體作為陰性對(duì)照。陽(yáng)性對(duì)照：用已知陽(yáng)性絨癌組織切片做Me l-CAM的陽(yáng)性對(duì)照，乳腺癌組織切片做Ki-67的陽(yáng)性對(duì)照。
1.4 結(jié)果判斷
①M(fèi)el-CAM標(biāo)記IT的比例。每張切片觀察10個(gè)高倍視野(×400)，每個(gè)高倍視野計(jì)數(shù)100個(gè)滋養(yǎng)細(xì)胞，計(jì)算其中Mel-CAM陽(yáng)性染色細(xì)胞所占的比例。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<25%為陰性(-)，25%-50%為弱陽(yáng)性(＋)，50%-75%為陽(yáng)性(?)，>75%為強(qiáng)陽(yáng)性(?)。②Ki-67標(biāo)記指數(shù)。每張切片觀察10個(gè)高倍視野(×400)，每個(gè)高倍視野計(jì)數(shù)100個(gè)中間型滋養(yǎng)細(xì)胞，計(jì)算其中Ki-67陽(yáng)性核的IT的百分比。
1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
所有資料采用SPSS13.0軟件分析。資料為等級(jí)計(jì)數(shù)資料，采用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)，雙側(cè)P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2 結(jié)果
2.1 Mel-CAM的表達(dá)
Mel-CAM表達(dá)僅見于IT，表現(xiàn)為均勻一致的線性染色包繞于整個(gè)IT表面。ST和CT無表達(dá)，蛻膜、內(nèi)膜腺體和基質(zhì)炎癥細(xì)胞對(duì)Mel-CAM均為陰性表達(dá)。IT的Mel-CAM染色不僅表達(dá)在單核IT中，多核IT表面也可見表達(dá)，展示了一個(gè)IT變化的系列形態(tài)(圖1、圖2)。這可能顯示了從CT向ST轉(zhuǎn)變的一個(gè)中間階段。無論在正常絨毛還是葡萄胎組織中，所有的Mel-CAM陽(yáng)性細(xì)胞的染色強(qiáng)度無明顯差異。
在正常絨毛表面未見Mel-CAM表達(dá)，滋養(yǎng)細(xì)胞柱和浸潤(rùn)蛻膜的部分絨毛外IT中可見染色。這種染色模式在一定程度上反映了細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞在絨毛表面和絨毛外的不同分化途徑，以及不同類型滋養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)特點(diǎn)。
在葡萄胎組織的Mel-CAM陽(yáng)性染色不僅出現(xiàn)在絨毛外IT，絨毛表面也有滋養(yǎng)細(xì)胞的表達(dá)(圖1-圖4)。葡萄胎組織中Mel-CAM染色的陽(yáng)性細(xì)胞比例較正常絨毛組織染色明顯增加，二者間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
2.2 Ki-67的表達(dá)
Ki-67蛋白著色部位在細(xì)胞核中，為棕黃色顆粒狀，顆粒顏色深淺不一，大小各異。CT、IT及蛻膜細(xì)胞和部分淋巴細(xì)胞的細(xì)胞核均可見陽(yáng)性染色，以CT的表達(dá)為主，ST中無表達(dá)。在正常絨毛中，僅有絨毛內(nèi)層的部分CT 表達(dá)Ki-67，少數(shù)IT可見陽(yáng)性染色，ST均為陰性。葡萄胎中絨毛內(nèi)層大多數(shù)CT均對(duì)Ki-67有陽(yáng)性染色，部分浸潤(rùn)的IT有著色，ST無表達(dá)(圖1-圖4)。
2.3 Mel-CAM標(biāo)記IT的增殖
正常絨毛中，大部分Mel-CAM標(biāo)記IT，包括多核IT，不顯示Ki-67染色；而葡萄胎中Mel-CAM標(biāo)記IT的Ki-67染色明顯增加，絨毛表面和浸潤(rùn)的IT中均有表達(dá)，Ki-67標(biāo)記指數(shù)見表1。與正常絨毛相比，葡萄胎組織中Mel-CAM標(biāo)記IT的Ki-67標(biāo)記指數(shù)水平較高，二組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表1 Ki-67在Mel-CAM標(biāo)記IT中的表達(dá)（略）
3 討論
黑素瘤細(xì)胞黏附分子(melanoma cell adhesion molecule, Mel-CAM)又稱CD146或MUC18，是一種單鏈跨膜糖蛋白，屬免疫球蛋白超家族(immunoglobulins superfamily, IGSF)的成員。Mel-CAM位于細(xì)胞膜表面，包括五個(gè)特征性的免疫球蛋白(Ig)樣結(jié)構(gòu)域(V-V-C2-C2-C2)，一個(gè)跨膜區(qū)和一個(gè)細(xì)胞漿內(nèi)短尾，與許多細(xì)胞黏附分子(cell adhesion molecule, CAM)有同源性［1］。最早發(fā)現(xiàn)Mel-CAM在黑素瘤細(xì)胞上表達(dá)，參與細(xì)胞間及細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)間黏附，在正常組織細(xì)胞間的黏附和腫瘤細(xì)胞的黏附、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移中均起到重要的作用［2］。后來發(fā)現(xiàn)Mel-CAM是一個(gè)高敏感和特異的IT標(biāo)記物，在絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞柱和絨毛外中間型滋養(yǎng)細(xì)胞的所有亞型中表達(dá)，而在CT和ST中則無，為IT代表滋養(yǎng)細(xì)胞的一個(gè)獨(dú)特亞群的觀點(diǎn)提供了更進(jìn)一步的證據(jù)［3］，并且在絨毛植入、胎盤形成和滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移中起到重要作用。因此，在正常胚胎種植和妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病中得到了廣泛的研究。通過我們的研究也發(fā)現(xiàn)，Mel-CAM表達(dá)僅限于正常絨毛和葡萄胎組織中的IT，故可作為一種標(biāo)記物以區(qū)分起源于不同滋養(yǎng)細(xì)胞群的病變，如超常胎盤部位、胎盤部位滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤及絨癌等的鑒別診斷，為臨床病理學(xué)的工作提供了很大地便利條件。
本研究中，正常早孕絨毛組織的Mel-CAM僅表達(dá)于滋養(yǎng)細(xì)胞柱和浸潤(rùn)蛻膜的絨毛外IT中，而絨毛表面的滋養(yǎng)細(xì)胞無表達(dá)。該結(jié)果與一些學(xué)者的研究相一致［4-5］。眾所周知，胚胎植入的過程主要是依賴滋養(yǎng)細(xì)胞柱及絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞對(duì)子宮蛻膜的侵襲浸潤(rùn)完成的，說明Mel-CAM與滋養(yǎng)細(xì)胞的黏附浸潤(rùn)有關(guān)。Shih等［6］認(rèn)為子宮平滑肌細(xì)胞可能表達(dá)Mel-CAM受體，該受體與IT表面上的Mel-CAM蛋白相結(jié)合，從而參與了種植過程中滋養(yǎng)細(xì)胞在子宮內(nèi)膜和肌層內(nèi)的浸潤(rùn)，而侵襲性較強(qiáng)的葡萄胎組織中Mel-CAM的表達(dá)較正常絨毛明顯增加，二者間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，也進(jìn)一步證明了Mel-CAM與滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤(rùn)能力有關(guān)。有學(xué)者認(rèn)為［2］，腫瘤細(xì)胞間Mel-CAM和Mel-CAM受體的相互作用引起了腫瘤細(xì)胞的聚集，而Mel-CAM陽(yáng)性的內(nèi)皮細(xì)胞則可介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞貼附于血管內(nèi)皮，侵入周圍組織�？梢�，Mel-CAM在正常胚胎植入、滋養(yǎng)細(xì)胞的分化以及滋養(yǎng)細(xì)胞的黏附浸潤(rùn)過程中都起到了重要的作用，可以作為一個(gè)臨床上預(yù)測(cè)妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病的侵蝕能力，判斷疾病的惡性程度的輔助工具。
在正常絨毛和葡萄胎組織中，Mel-CAM的免疫染色特征相同，為IT表面均勻一致的線性染色，CT和ST均無表達(dá)。但是，二者在絨毛表面的表達(dá)模式不同。正常早孕絨毛中，Mel-CAM在絨毛表面無表達(dá)，僅見于滋養(yǎng)細(xì)胞柱和絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞中。這顯示了正常早孕絨毛中CT的兩個(gè)不同的分化方向：絨毛表面的CT直接融合為成熟的ST；而在滋養(yǎng)細(xì)胞柱上經(jīng)過了IT這個(gè)中間過渡階段。而葡萄胎中Mel-CAM的表達(dá)既可見于絨毛表面，也可見于浸潤(rùn)的IT中。這說明在葡萄胎組織絨毛表面的CT分化失調(diào)，不僅可以直接分化為ST，也可經(jīng)過IT分化為ST，表現(xiàn)出雙重分化途徑。這種分化模式與葡萄胎的發(fā)病機(jī)制間有何關(guān)系還有待于進(jìn)一步的研究。
Ki-67是目前國(guó)際上研究非常多的一個(gè)細(xì)胞增殖標(biāo)記物。Ki-67蛋白被認(rèn)為普遍存在于細(xì)胞核中，與增生密切相關(guān)，可在除G0期外的所有細(xì)胞周期中表達(dá)，具有許多細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白的特征。有學(xué)者認(rèn)為它涉及了細(xì)胞周期的檢查點(diǎn)控制機(jī)制［7］�，F(xiàn)在Ki-67已經(jīng)被廣泛用于檢測(cè)腫瘤組織中細(xì)胞的增生情況，在乳腺癌、胃癌、結(jié)腸癌、黑色素瘤等多種腫瘤中的表達(dá)顯著增高，被認(rèn)為是一個(gè)非常有價(jià)值的增殖標(biāo)記物。正常早孕絨毛組織中Ki-67主要在CT中表達(dá)，而ST中則無陽(yáng)性染色［8］。眾所周知，正常早孕時(shí)，CT為滋養(yǎng)細(xì)胞的干細(xì)胞，細(xì)胞核分裂活躍，隨著CT的分化，其浸潤(rùn)能力增高而增殖能力喪失。ST是已經(jīng)分化成熟的細(xì)胞，徹底喪失了增殖能力。因此，CT中可見陽(yáng)性表達(dá)，而ST內(nèi)未見到陽(yáng)性染色。這是與滋養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)功能相一致的。在葡萄胎中，滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖分化失控，不僅在絨毛基底部的CT中有Ki-67的表達(dá)，浸潤(rùn)的IT中也可見大量陽(yáng)性染色。提示葡萄胎中，滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤(rùn)能力增加的同時(shí)其增殖能力不僅沒有喪失，反而有所提高，導(dǎo)致了疾病的發(fā)生。比較正常絨毛和葡萄胎組織中IT的Ki-67標(biāo)記指數(shù)，后者明顯增高，二者間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明檢測(cè)葡萄胎組織中IT的Ki-67指數(shù)對(duì)于預(yù)測(cè)葡萄胎的轉(zhuǎn)歸有潛在的價(jià)值。
綜上所述，Mel-CAM是一個(gè)非常有價(jià)值的標(biāo)記物。它的發(fā)現(xiàn)為研究IT在妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病中的作用，以及滋養(yǎng)細(xì)胞的黏附、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移有很大的幫助。在正常胚胎著床和妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病的發(fā)生發(fā)展中起到了不可替代的作用，具有廣泛的應(yīng)用前景。而異常增殖的IT在妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病的發(fā)生發(fā)展以及疾病的特征中擔(dān)任了重要的角色，仍需要進(jìn)一步的研究。
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