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肝細(xì)胞生長因子對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖影響的實(shí)驗(yàn)研究論文
目的 觀察肝細(xì)胞生長因子（HGF）對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HEC?2B增殖的影響及子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HEC?2B中HGF受體C?met的表達(dá)，了解HGF對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的作用及其機(jī)制。方法 體外培養(yǎng)人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HEC?2B，用RT?PCR的方法檢測HEC?2B中HGF受體C?met有表達(dá)。對(duì)HEC?2B進(jìn)行24 h血清饑餓后用不同劑量的HGF作用于HEC?2B。用四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法(MTT法)分析細(xì)胞的增殖力，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的增殖周期。結(jié)果 C?met在HEC?2B細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，HGF促進(jìn)細(xì)胞的增殖，并在一定的范圍內(nèi)有劑量依賴關(guān)系，各處理組與對(duì)照組相比，P<0.05。當(dāng)HGF濃度達(dá)到60 ng· mL-1時(shí)，增殖水平較對(duì)照上調(diào)約1.9倍。結(jié)論 HGF/C?met能夠在體外促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖。Abstract:Objective To study the effects of hepatocyte growth factor on endometrial cancer cells, detect the alterations of cell proliferation and expression level of HGF receptor C?met and understand the molecular mechanism. Methods Endometrial cancer cell line, HEC?2B was cultured in vitro. The expression level of C?met in HEC?2B was determined with RT?PCR. HEC?2B was treated with HGF at different doses. Cell proliferation was analyzed with MTT assay. Cell cycle distribution was examined with FACS. Statistical evaluations were conducted using t?test. Results C?met was expressed in HEC?2B cells. Compared with controls, HGF could promoted the proliferation of HEC?2B in a dose?dependent manner (P<0.05). Treatment with 60 ng· mL-1 HGF increased the proliferation level by 1.9 fold. Conclusion C?met was expressed stably in HEC?2B cells. HGF/C?met system promoted the formation, development and proliferation of endometrial cancer cells in vitro.
Key words:endometrial cancer cell; hepatocyte growth factor; hepatocyte growth factor receptor
子宮內(nèi)膜癌是女性生殖道常見三大惡性腫瘤之一，近20年來在世界范圍內(nèi)子宮內(nèi)膜癌發(fā)病率有上升趨勢。肝細(xì)胞生長因子(HGF)是一個(gè)多功能生長因子。HGF的單一受體C?met是一跨膜蛋白，由原癌基因C?met編碼。在許多惡性腫瘤中C?met被過表達(dá)［1-6］。HGF/C?met與子宮內(nèi)膜癌的關(guān)系卻鮮有報(bào)道。本研究通過觀察子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中C?met的表達(dá)及HGF對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的作用，旨在為臨床以HGF／C?met為靶點(diǎn)治療子宮內(nèi)膜癌提供理論基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1 試劑與細(xì)胞株
子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株HEC?2,購自中科院細(xì)胞庫;RNase、胰蛋白酶、DMEM 培養(yǎng)基、Trizol、逆轉(zhuǎn)錄酶Superscript Ⅲ為Invitrogen公司產(chǎn)品;優(yōu)質(zhì)胎牛血清，Gibco公司;HGF購自R&D， Agarose 、G418 由Sigma公司提供。PCR用酶SYBR Green PCR Master Mix購自ABI公司。EPICS AL TRA流式細(xì)胞儀，美國Beckman Coulter公司提供。
1.2 HEC?2B細(xì)胞的體外培養(yǎng)與誘導(dǎo)
將細(xì)胞以1×105/cm2接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，每瓶加入5 mL含10%(φ)FBS（胎牛血清）的DMEM；培養(yǎng)24 h后，換5%FBS的DMEM饑餓培養(yǎng)12 h，分別加入濃度為20、40、60、80、100ng·mL-1的HGF進(jìn)行處理，設(shè)置空白組不進(jìn)行誘導(dǎo)，培養(yǎng)基中FBS的濃度改成5%；培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞。
1.3 PCR
用PBS清洗細(xì)胞，用Trizol法抽提RNA，并常規(guī)檢測RNA的純度及完整性。反轉(zhuǎn)錄，用人的β?actin基因檢測反轉(zhuǎn)錄是否成功。PCR條件為：94 ℃ 5 min 激活聚合酶，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃45 s，共33循環(huán)，72 ℃保溫10 min，4 ℃保溫10 min。采用瓊脂糖凝膠檢測的方法進(jìn)一步驗(yàn)證。Realtime定量PCR條件為：95 ℃ 5 min 激活聚合酶，95 ℃變性15 s，57 ℃退火5 s，72 ℃ 25 s，共45循環(huán)。采用ABI7300系統(tǒng)進(jìn)行檢測，每個(gè)循環(huán)結(jié)束檢測熒光強(qiáng)度。融解曲線分析：每分鐘讀1次，檢測范圍為55 ℃ 到 95 ℃。熒光強(qiáng)度檢測采用動(dòng)態(tài)跟蹤的方法，自動(dòng)測出Ct值（每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)所設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)），用2?△△Ct 表示實(shí)驗(yàn)組目的基因的表達(dá)相對(duì)于對(duì)照組的變化倍數(shù)，并采用瓊脂糖凝膠檢測的方法進(jìn)一步驗(yàn)證。Β?actin引物序列如下：上游引物 5′?gctct tttcc agcct tcctt?3′,下游引物 5′? tgatc cacat ctgct ggaag?3′。C?met檢測引物序列：上游引物5′?ttcaagtagc caaagcgatg?3′,下游引物 5′?gtgtttacgtcaggataag?3′ 。C?met檢測引物序列：上游引物5′?ttcaagtagc caaagcgatg?3′,下游引物 5′?gtgtttacgtcaggataag?3′,產(chǎn)物大小300 bp。
1.4 用MTT法檢測細(xì)胞增殖能力
取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，用含0.25%(φ)胰酶消化，懸浮于適量培養(yǎng)基中，通過細(xì)胞計(jì)數(shù)將其濃度調(diào)整到4×104個(gè)細(xì)胞/mL。將此細(xì)胞懸液以100 μL/孔均勻接種到細(xì)胞培養(yǎng)板上，置于37 ℃，5％CO2的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h后，換成稀釋液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞饑餓。分組加藥，分別將含20、40、60、80、100 ng· mL-1HGF的培養(yǎng)液100 μL加入細(xì)胞培養(yǎng)孔中，每個(gè)稀釋度做4個(gè)復(fù)孔，設(shè)立空白對(duì)照組。加樣后置于37 ℃，5％CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)44 h，每孔加入20 μL MTT染色液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；棄去培養(yǎng)液，加入抽提液150 μL/孔，置于微量振蕩器張充分振勻以抽取染料，振動(dòng)15 min。以570 nm為檢測波長，630 nm為參考波長，用酶標(biāo)儀測定各孔的吸光值（A）
1.5 流式細(xì)胞檢測
消化并收集細(xì)胞，每檢測管中(0.5～1)×106細(xì)胞，PBS清洗一遍，離心去上清，轉(zhuǎn)速1 000 r/ min，5 min，沿管壁緩慢加入終濃度70％(φ)的乙醇，混勻，－20 ℃ 固定過夜，1 000 r/min 離心5 min去上清，PBS清洗一遍，加入Rnase抑制劑50 μL，加入50 μg/mL的PI染料混勻，4 ℃ 避光30 min，上機(jī)檢測。
1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
采用t檢驗(yàn)，P<0.05 為差異有顯著性。
2 結(jié) 果
2．1 HEC?2B的培養(yǎng)與傳代
HEC?2B為起源于子宮內(nèi)膜癌的細(xì)胞系，在10% 胎牛血清( Fetal Calf Serum, FCS)，DMEM培養(yǎng)基，5％ CO2，37℃的培養(yǎng)條件下，細(xì)胞生長良好，其形態(tài)見圖1所示。
將上述總RNA逆轉(zhuǎn)錄后，采用PCR的方法進(jìn)行擴(kuò)增，電泳后進(jìn)行EB染色（圖3），發(fā)現(xiàn)得到條帶的大小與預(yù)計(jì)的300 bp相符合，表明在HEC?2B細(xì)胞中具有C?met基因的轉(zhuǎn)錄。
經(jīng)反復(fù)后傳5、10、15、20、25代后，抽提總RNA，各樣品之間RNA的量相近，C?met的轉(zhuǎn)錄水平基本維持不變。各組之間比較，P>0.05,差異無顯著性。結(jié)果見圖4、表1所示。
表1 RT?PCR測得C?met表達(dá)水平（略）
2．3 HGF對(duì)HEC?2B的影響
2．3.1 MTT法檢測結(jié)果
20 ng· mL-1的HGF即能夠明顯促進(jìn)HEC?2B的增殖，并表現(xiàn)為劑量依賴關(guān)系，當(dāng)HGF濃度達(dá)到60 ng·mL-1時(shí)，增殖水平較對(duì)照上調(diào)約1.9倍，此后有所下降，100 ng·mL-1的HGF仍能夠明顯促進(jìn)HEC?2B的增殖（圖5）。
2．3.2 流式細(xì)胞檢測結(jié)果
用20 ng·mL-1HGF處理HECT?2B細(xì)胞，即可使處于G1細(xì)胞比例減少，處于G2+S期細(xì)胞增多，當(dāng)HGF濃度增加到60 ng·mL-1時(shí)，G1期細(xì)胞最少，G2+S期細(xì)胞最多。增殖指數(shù)（proliferation index, PI）可以用來反映細(xì)胞的增殖狀況，各濃度的HGF處理組都可以明顯促進(jìn)HECT?2B細(xì)胞的增殖。結(jié)果見圖6與表2所示。表2 HGF處理對(duì)HEC?2B細(xì)胞增殖周期的影響（略）
3 討 論
肝細(xì)胞生長因子(HGF)首先從部分肝臟切除的大鼠的血清中提取，由于其對(duì)肝細(xì)胞具有強(qiáng)的絲裂原作用，因此命名為肝細(xì)胞生長因子［7］。HGF的單一受體C?met是一跨膜蛋白，由原癌基因C?met編碼［5］。許多文獻(xiàn)報(bào)道C?met在較多腫瘤中都有較高表達(dá)，這些腫瘤包括：卵巢癌［1］、腎癌［2］、膀胱癌［3］、乳腺癌［4］、胰腺癌［5］與前列腺癌［6］。但HGF/C?met在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展中所起作用卻鮮有報(bào)導(dǎo)。
正常細(xì)胞的生長過程是一種有控生長，且會(huì)逐步分化；腫瘤細(xì)胞則生長失控化，幼稚化。腫瘤細(xì)胞體的不穩(wěn)定性和非整倍體細(xì)胞的出現(xiàn)即是由這種細(xì)胞周期調(diào)節(jié)機(jī)制失控所造成的［7］。這種失控也使腫瘤細(xì)胞在傳代時(shí)可能發(fā)生一些自發(fā)的重組而導(dǎo)致一些基因的啟動(dòng)子丟失，使這些基因不表達(dá)或表達(dá)量減少。本實(shí)驗(yàn)檢測了HEC?2B細(xì)胞中C?met的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)C?met的mRNA能夠持續(xù)存在于HEC?2B細(xì)胞中。在體外持續(xù)的傳代多達(dá)25次，仍能夠檢測到C?met的mRNA，而且數(shù)量沒有明顯的變化，充分說明在很長的時(shí)間范圍內(nèi)，C?met的啟動(dòng)子能夠被持續(xù)穩(wěn)定地激活，說明該基因表達(dá)對(duì)HEC?2B具有較為重要的生理或病理學(xué)意義。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：MTT及流式細(xì)胞儀的結(jié)果均顯示：20 ng·mL-1的HGF促進(jìn)HEC?2B的增殖，當(dāng)HGF濃度達(dá)到60 ng·mL-1時(shí)，促增殖作用最強(qiáng)，此后作用稍減弱，HGF濃度達(dá)到100 ng·mL-1時(shí)仍有一定促增殖作用，在一定范圍內(nèi)表現(xiàn)為劑量依賴關(guān)系�？紤]與HGF是通過與受體結(jié)合來起作用有關(guān)：當(dāng)HGF與受體結(jié)合未達(dá)到飽和時(shí)，促增殖作用隨HGF濃度的增加而增強(qiáng)；當(dāng)與受體結(jié)合達(dá)飽和時(shí)，增殖作用便不呈現(xiàn)劑量依賴性。內(nèi)膜癌細(xì)胞中有C?met的表達(dá)，HGF能有效促進(jìn)內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖。在體內(nèi)，HGF是否與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展直接相關(guān)，問題的關(guān)鍵在于體內(nèi)是否存在HGF直接作用于子宮內(nèi)膜癌組織的可能性。
研究表明，在體內(nèi)HGF可由子宮內(nèi)膜上皮下層的基質(zhì)細(xì)胞來分泌表達(dá)［8］ 。 HGF對(duì)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的作用是以旁分泌的方式進(jìn)行的。這樣就給子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展提供了營養(yǎng)支持。Yoshida等［9］認(rèn)為，腫瘤細(xì)胞能夠分泌堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)，而基質(zhì)細(xì)胞膜上有bFGF的受體，一旦與配體結(jié)合后，即能夠促進(jìn)HGF的表達(dá)上調(diào)，反過來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長。
本研究提示，HGF/C?met能夠在體外促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展與增殖。研究發(fā)現(xiàn)C?met是一個(gè)極有希望的治療靶點(diǎn)，一些HGF的拮抗劑已進(jìn)入治療腫瘤的實(shí)驗(yàn)階段［10］。這一結(jié)果為通過阻斷 HGF/C?met系統(tǒng)的表達(dá)或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路治療內(nèi)膜癌提供了新思路。
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