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紫杉醇改變FADD在食管鱗癌中的表達(dá)
下面是小編整理的本科畢業(yè)醫(yī)學(xué)論文，歡迎參考與閱讀!
【摘要】 目的 人食管鱗癌細(xì)胞株Eca109中Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白(Fas associated death domain protein, FADD)表達(dá)與 紫杉醇的關(guān)系影響分析,紫杉醇在食管鱗癌治療中的作用機(jī)制探討。方法 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度紫杉醇處理下，人食管癌細(xì)胞株Eca109細(xì)胞凋亡率，同時(shí)采用Western blotting分析細(xì)胞中FADD的表達(dá)變化。結(jié)果 紫杉醇誘導(dǎo)人食管癌細(xì)胞株Eca109細(xì)胞凋亡呈劑量依賴性;隨著紫杉醇劑量的增加，實(shí)驗(yàn)組Eca109細(xì)胞中FADD表達(dá)呈顯著增高。結(jié)論 一定劑量的紫杉醇可以提高FADD在食管癌細(xì)胞中的表達(dá)、促進(jìn)食管癌細(xì)胞的凋亡，這可能是紫杉醇治療食管癌的分子機(jī)制之一。
【關(guān)鍵詞】 紫杉醇;食管癌;凋亡;FADD
食管癌是常見消化道惡性腫瘤之一，其發(fā)病隱匿,確診時(shí)大多已屬于中晚期，使很多患者在手術(shù)前后需要接受化學(xué)治療,以確保手術(shù)效果，同時(shí)化療也為很多失去手術(shù)機(jī)會(huì)的患者提供了治療的機(jī)會(huì)。紫杉醇品名為Taxol，最早是Wall和Wani于1963 年從太平洋紅豆杉的皮中提取得到[1]，經(jīng)過臨床試驗(yàn)后近年來已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床包括食管癌在內(nèi)的多種腫
瘤的化療中。紫杉醇可作用于細(xì)胞凋亡受體途徑的Fas/FasL 通路或激活凋亡啟動(dòng)途徑的半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶系統(tǒng)(caspases), 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[2,3]，而FADD是Fas/FasL凋亡系統(tǒng)中的必需分子，不僅參與細(xì)胞凋亡過程的發(fā)生，還與細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)有關(guān)。研究[4]證實(shí)從食管正常黏膜到不典型增生的組織中，F(xiàn)ADD蛋白及mRNA表達(dá)呈現(xiàn)顯著下降趨勢(shì)。已有臨床研究[5,6]表明紫杉醇聯(lián)合順鉑、奈達(dá)鉑、氟尿嘧啶等藥物治療食管癌,可以提高其總有效率,且毒副作用無明顯增加，患者耐受性較好，表明紫杉醇在食管癌治療中具有很高的臨床應(yīng)用價(jià)值。同時(shí)紫杉醇對(duì)人食管癌細(xì)胞的生長有明顯的抑制作用, 使細(xì)胞分裂阻滯于G2-M 期, 并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[7]。但現(xiàn)有研究并沒有對(duì)這一過程中食管癌細(xì)胞中FADD的表達(dá)變化情況作進(jìn)一步研究。
作者通過檢測(cè)不同濃度紫杉醇誘導(dǎo)人食管鱗癌細(xì)胞株Ec-109 細(xì)胞凋亡,并檢測(cè)細(xì)胞表達(dá)FADD蛋白的變化情況，探討紫杉醇抑制人食管癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制,為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
1 材料和方法
1.1 試劑與藥物 泰素(紫杉醇的商品名, 由百時(shí)美施貴寶公司惠供, 6 g/L, 分子質(zhì)量8539 u)，RPMI1640培養(yǎng)液、005%的胰蛋白酶及小牛血清為Hyclone產(chǎn)品, Annexin V(FITC)/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購于杭州隆基生物工程研究所, 蛋白提取液購于Pierce公司，兔抗人FADD單克隆抗體及鼠抗人β-actin單克隆抗體購于Santa Cruz公司，考馬斯亮藍(lán)試劑盒購于南京建成生物科技有限公司。
1.2 細(xì)胞與細(xì)胞培養(yǎng) 人食管癌細(xì)胞株Eca-109(ATCC)由上海麥莎生物科技有限公司代購。細(xì)胞接種于含10% 小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng), 生長于37℃含5% 的CO2孵箱中, 待細(xì)胞生長至對(duì)數(shù)生長期開始實(shí)驗(yàn)。胰蛋白酶消化細(xì)胞后培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為5×10.5/ml接種于6孔培養(yǎng)板進(jìn)行培養(yǎng)， 24 h后更換新鮮培養(yǎng)液，同時(shí)實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)液中分別加入終濃度為 5、10、20、50 nmol/L 泰素，對(duì)照組不加藥物，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后收集各組細(xì)胞。
1.3 凋亡檢測(cè)
收集每組細(xì)胞后PBS洗滌離心，細(xì)胞重懸于300 μl Banding buffer中，加入5 μl AnnexinV-FITC混勻，室溫避光孵育15 min，再加入5 μl PI，室溫避光孵育5 min，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，同時(shí)以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作為對(duì)照。
14 Western blotting 分別收集每組細(xì)胞，PBS洗滌離心后，加入含蛋白酶抑制劑的蛋白提取液，提取細(xì)胞總蛋白并調(diào)整蛋白濃度后100℃煮沸變性。取適量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，半干法轉(zhuǎn)膜，封閉，按1：1000分別孵育兔抗人FADD單克隆抗體及鼠抗人β-actin單克隆抗體，4℃過夜后洗膜，按1：1000分別孵育羊抗兔及羊抗鼠二抗，洗膜，化學(xué)發(fā)光底物顯影照相后進(jìn)行圖片分析及數(shù)據(jù)采集。
1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 130軟件分析處理，統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用t檢驗(yàn)，組間比較采用單因素方差分析，P<005表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2 結(jié)果
21 紫杉醇誘導(dǎo)人食管癌細(xì)胞株Eca-109凋亡檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率顯著高于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組中紫杉醇藥物濃度5 nmol/L組與10 nmol/L之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，藥物濃度升高至20 nmol/L和50 nmol/L后細(xì)胞凋亡率顯著升高，與5 nmol/L組和10 nmol/L之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖1。
22 細(xì)胞表達(dá)FADD 蛋白水平檢測(cè) 檢測(cè)結(jié)果顯示，所有實(shí)驗(yàn)組中Eca-109細(xì)胞表達(dá)FADD蛋白水平較對(duì)照組均有升高，見圖2，a。但僅紫杉醇藥物濃度為20 nmol/L組和50 nmol/L組中細(xì)胞表達(dá)
3 討論
研究結(jié)果顯示，紫杉醇能誘導(dǎo)人食管癌細(xì)胞株Eca-109細(xì)胞凋亡，當(dāng)紫杉醇濃度達(dá)到20 nmol/L和50 nmol/L時(shí)，細(xì)胞凋亡率顯著升高。這一研究結(jié)果提示，只有紫杉醇達(dá)到一定血藥濃度后，才會(huì)對(duì)食管癌細(xì)胞產(chǎn)生抗癌作用。低濃度紫杉醇作用可能只會(huì)抑制細(xì)胞增殖，并不一定能引起食管癌細(xì)胞的凋亡。FADD是FAS受體和部分TNF死亡受體家族成員介導(dǎo)信號(hào)通路中的胞質(zhì)死亡信號(hào)銜接蛋白，其羧基端的死亡結(jié)構(gòu)域DD與Fas分子胞漿段內(nèi)的DD結(jié)合，當(dāng)Fas與FasL結(jié)合導(dǎo)致Fas胞內(nèi)的死亡域形成三聚體而活化,并引起與之結(jié)合的FADD構(gòu)象改變,使Caspase- 8前體集聚、斷裂和激活,產(chǎn)生有活性的Caspase - 8,從而激發(fā)一系列下游的Caspase - 3 等級(jí)聯(lián)反應(yīng), 誘發(fā)細(xì)胞凋亡[8]。檢測(cè)結(jié)果顯示，當(dāng)紫杉醇誘導(dǎo)人食管癌細(xì)胞株Eca-109細(xì)胞凋亡時(shí)，細(xì)胞表達(dá)FADD蛋白水平顯著升高，而低濃度組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這表明紫杉醇可能通過Fas/FasL途徑在食管癌治療中起作用，一定劑量的紫杉醇可以誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞FADD表達(dá)水平的升高，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡。這也提示在抗腫瘤治療過程中，紫杉醇的用量也是關(guān)鍵。
食管癌的治療是一個(gè)綜合治療的過程，化療只是所有治療方法中的一種。紫杉醇雖然在食管癌臨床治療中已經(jīng)顯現(xiàn)出一定的價(jià)值，但仍無法徹底改變食管癌疾病的預(yù)后。作者也僅僅選用了食管癌中的鱗癌細(xì)胞株作研究，還不能代表食管癌所有病理類型，將進(jìn)一步深入研究，以期能為食管癌的治療提供更為有價(jià)值的理論基礎(chǔ)。
參 考 文 獻(xiàn)
[1] Wani M C, Taylor H L, Wall M E,et al. Am. Chem. Soc, 1971, 93:2325-2327.
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[4] 許欣,彭林濤,劉麗華,等.食管上皮癌變過程中FAS、FASL、FADD和caspase-8的表達(dá)及其意義.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床,2007，5(27)：525-529.
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