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石仙桃中總黃酮的提取和含量檢測
石仙桃系蘭科石仙桃屬植物石仙桃(Phoidotaof chinensis Lindl.)的全草，俗稱石上蓮、石橄欖、石穿盤等，始載于《生草藥性備要》。其性甘味涼，具有養(yǎng)陰、清熱、利濕消瘀的功效，民間常用來治療高血壓病、頭暈和各種原因引起的頭痛。石仙桃屬植物全球約30種，中國有14種，產(chǎn)于南方，尤以西南地區(qū)多見。下面小編就為大家整理關(guān)于石仙桃中總黃酮的提取和含量檢測的路我嫩，希望可以幫助各位生物制藥的同學(xué)哦!
摘要：采用單因素試驗及正交試驗設(shè)計，利用乙醇溶劑浸提結(jié)合微波輔助提取法對石仙桃(Phoidotaof chinensis Lind L.)總黃酮的提取工藝進行優(yōu)化，并用分光光度計比色法測定提取的總黃酮含量。結(jié)果表明，石仙桃總黃酮提取的最佳工藝條件為微波功率300 W，提取時間30 min，溫度60 ℃，料液比(m∶V，g∶mL)1∶20，乙醇體積分數(shù)80%。按照最佳工藝條件進行提取，石仙桃總黃酮提取量達31.41 mg/g。
關(guān)鍵詞：石仙桃(Phoidotaof chinensis Lind L.);總黃酮;提取工藝;含量測定;正交試驗
研究表明，石仙桃主要化學(xué)成分為萜類、酚類、木脂素類、黃酮類，多糖等。目前石仙桃化學(xué)成分的定量研究主要是對揮發(fā)油等的研究，目前尚未發(fā)現(xiàn)對石仙桃總黃酮提取工藝的研究。為此采用微波提取法提取石仙桃總黃酮，以石仙桃總黃酮提取量為考察指標(biāo)，通過單因素試驗和正交試驗，探究微波法提取石仙桃總黃酮的最佳工藝，旨在為石仙桃進一步研究和資源開發(fā)利用提供一定的依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 試劑與儀器
石仙桃全草采自贛南;蘆丁對照品由北京恒元啟天化工技術(shù)研究院提供。
WF-4000C型常壓微波快速反應(yīng)系統(tǒng)(上海屹堯分析儀器有限公司);λ-35型紫外可見分光光度計(美國鉑金埃爾默公司);DZF-6050型烘箱(上海一恒科技有限公司);ABl35-S型電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多集團)。
1.2 方法
1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 稱取蘆丁對照品2.70 mg，用體積分數(shù)70%的乙醇溶解，10 mL容量瓶定容至刻度，配成0.27 mg/mL蘆丁對照品溶液，分別取0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mL至10 mL具塞試管中，加水至5 mL，加5%亞硝酸鈉0.6 mL，搖勻放置6 min，加10%硝酸鋁0.6 mL，搖勻放置6 min，加4%氫氧化鈉3.0 mL，搖勻， 加水至刻度，搖勻放置15 min。另取一10 mL具塞試管，不加對照品溶液，只加顯色劑，按照上法制成空白對照。采用紫外可見分光光度計在510 nm波長處測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線：A=12.971 C-0.0076，r=0.999 6，A表示吸光度，C表示蘆丁溶液濃度。蘆丁溶液濃度C在0.010 8～0.0648 mg/mL范圍內(nèi)與吸光度A有良好的線性關(guān)系。
1.2.2 微波法提取石仙桃總黃酮 稱取2.000 g石仙桃粗粉至500 mL微波提取罐中，一定條件下提取，減壓抽濾，回收濾液至少量，用70%乙醇定容至50 mL，制成待測溶液。取待測溶液5 mL， 加入15 mL 70%乙醇，搖勻，即稀釋4倍。取稀釋液2 mL，按“1.2.1”方法顯色，制成10 mL顯色液及空白對照，在510 nm下測定其吸光度A，按回歸方程計算出樣品溶液中的總黃酮含量(mg/mL)，根據(jù)稀釋倍數(shù)及樣品質(zhì)量換算出樣品中總黃酮的含量(mg/g)。
2 結(jié)果與分析
2.1 單因素試驗結(jié)果
2.1.1 微波提取功率對石仙桃總黃酮提取量的影響 稱取石仙桃樣品2.000 g，按液料比(V/m，下同)20∶1，乙醇體積分數(shù)70%，提取時間15 min，提取溫度70 ℃，分別在功率100、200、300、400、500、600、700 W條件下提取石仙桃總黃酮，結(jié)果見圖1(圖中數(shù)據(jù)為3次重復(fù)的平均值，下同)。從圖1可以看出，當(dāng)微波功率小于300 W時，總黃酮提取量隨微波功率增大而增加，當(dāng)微波功率大于300 W時，總黃酮提取量隨微波功率增大而減小，這主要是因為當(dāng)微波功率較低時，通過吸收微波能量產(chǎn)生熱量的極性分子吸收的能量少，產(chǎn)生的熱量低，細胞內(nèi)溫度上升得慢，液態(tài)水氣化產(chǎn)生的壓力小，細胞膜的破碎度低，導(dǎo)致總黃酮的提取量低，隨著功率的增大，細胞膜的破碎程度不斷增大，總黃酮的提取量也隨之增大，但細胞膜的破碎度不可能無限增大，當(dāng)微波功率繼續(xù)增大時，總黃酮可能會分解，其他雜質(zhì)的溶解也會增加，故后續(xù)試驗微波功率選定300 W。
2.1.2 微波提取時間對石仙桃總黃酮含量的影響 稱取石仙桃樣品2.000 g，按微波功率300 W，液料比20∶1，乙醇體積分數(shù)70%，提取溫度70 ℃，分別在時間10、15、20、25、30、35、40 min條件下提取石仙桃總黃酮，結(jié)果見圖2。從圖2可以看出，當(dāng)提取時間低于30 min時，石仙桃總黃酮提取量隨提取時間的增加而增大，當(dāng)提取時間超過30 min時，石仙桃總黃酮提取量隨提取時間的增加而減少。這可能是因為加熱時間較短時，細胞內(nèi)極性分子吸收的微波能量較少，液態(tài)水氣化產(chǎn)生的壓力較小，對細胞膜被破壞的程度較小，故總黃酮提取量不高;隨著時間的延長，細胞內(nèi)極性分子吸收的微波能量增加，液態(tài)水氣化產(chǎn)生的壓力增大，細胞膜被微波破壞程度加大，但時間過長，雜質(zhì)的溶解也會增加，乙醇揮發(fā)量增加，總黃酮提取量下降，因此確定后續(xù)試驗提取時間為30 min。
2.1.3 提取溫度對石仙桃總黃酮含量的影響 稱取石仙桃樣品2.000 g，按微波功率300 W，提取時間30 min，液料比20∶1，乙醇體積分數(shù)70%，分別在溫度40、50、60、70、80、90 ℃條件下提取石仙桃總黃酮，結(jié)果見表1。從表1可以看出，60 ℃時石仙桃總黃酮含量最高，80 ℃時石仙桃總黃酮含量次之。 2.1.4 液料比對石仙桃總黃酮含量的影響 稱取石仙桃樣品2.000 g，按微波功率300 W，提取時間30 min，溫度60 ℃，乙醇體積分數(shù)70%，分別在液料比為10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1條件下提取石仙桃總黃酮，結(jié)果見圖3。從圖3可以看出，當(dāng)液料比低于20∶1時，石仙桃總黃酮提取量隨液料比的增加而增大，當(dāng)液料比高于20∶1時，石仙桃總黃酮提取量隨取液料比的增加而減少。
2.1.5 乙醇體積分數(shù)對石仙桃總黃酮含量的影響 稱取石仙桃樣品2.000 g，按微波功率300 W，提取時間30 min，溫度60 ℃，液料比20∶1，分別在乙醇體積分數(shù)為30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%條件下提取石仙桃總黃酮，結(jié)果見圖4。從圖4可知，當(dāng)乙醇體積分數(shù)低于80%時，石仙桃總黃酮提取量隨乙醇體積分數(shù)的增加而增大，當(dāng)乙醇體積分數(shù)高于80%時，石仙桃總黃酮提取量隨取乙醇體積分數(shù)的增加而減少。這是因為在植物中，黃酮類化合物多以苷類形式存在，黃酮苷元極性較小，糖基極性較大，根據(jù)相似相溶原理，隨著乙醇體積分數(shù)的增大，部分酯溶性黃酮溶解量增加。但當(dāng)乙醇體積分數(shù)較高時，水溶性黃酮的溶解度降低，并且乙醇體積分數(shù)較高會使細胞蛋白質(zhì)很快凝固，不利于乙醇向細胞內(nèi)滲透，溶解并釋放細胞內(nèi)黃酮類物質(zhì)，使總黃酮提取率下降。
2.2 正交試驗結(jié)果
2.2.1 微波提取石仙桃總黃酮的正交試驗設(shè)計 在單因素試驗基礎(chǔ)上，為進一步考察各因素對石仙桃總黃酮提取量影響程度，以及得出微波提取石仙桃總黃酮的最佳工藝條件，由于微波功率較低時，即300 W左右時，石仙桃的提取量已較高，為節(jié)約能源，將微波提取的最佳功率定為300 W。故只選擇提取時間、溫度、液料比、乙醇體積分數(shù)這4個因素為主要影響因素，進行四因素三水平的正交試驗，選用L9(34)正交表探究提取時間、溫度、液料比、乙醇體積分數(shù)對石仙桃總黃酮含量的影響程度大小及微波提取法的最佳工藝條件。L9(34)正交試驗結(jié)果及極差分析結(jié)果見表2。
由表2正交試驗數(shù)據(jù)可知，在微波功率為300 W條件下，各因素對石仙桃總黃酮含量的影響從大到小為乙醇體積分數(shù)、提取時間、溫度、液料比。由表2極差分析可知，石仙桃總黃酮含量的最佳工藝條件為A2B2C2D2，即微波功率為300 W，時間30 min，溫度60 ℃，液料比20∶1，乙醇體積分數(shù)為80%。
2.3 最佳工藝條件的驗證性試驗
精確稱取石仙桃樣品2.000 g，在最佳工藝條件A2B2C2D2下，按“1.2”的試驗方法操作，測定吸光度，并計算石仙桃總黃酮提取量。進行3次平行驗證性試驗，得到的驗證結(jié)果為在最佳工藝條件下，總黃酮的提取量為31.41 mg/g，RSD為0.85%。說明該工藝條件穩(wěn)定可行。
3 小結(jié)
在中草藥中黃酮類化合物提取方法主要有浸漬法、回流提取法、超聲提取法、微波提取法等。相比之下，微波法具有提取效率高、節(jié)省溶劑、污染小等優(yōu)點。微波法提取石仙桃總黃酮的工藝研究，單因素試驗得出的最佳條件為微波功率為300 W，時間30 min，溫度60 ℃，液料比20∶1，乙醇體積分數(shù)為80%，對時間、溫度、液料比、乙醇體積分數(shù)這4個因素進行四因素三水平正交試驗后，得出的結(jié)果與單因素試驗結(jié)果一致，且測定的黃酮含量的方法穩(wěn)定可靠，總黃酮的提取量可達31.41 mg/g。
參考文獻：
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