- 相關(guān)推薦
CCR3在哮喘豚鼠模型肺和骨髓中的表達及意義
又是一年畢業(yè)季!論文這個字眼對于上過大學(xué)的人來說都不陌生，甚至有的人提起它仍心有余悸，而那些沒寫過的聽之聞風(fēng)喪膽。下面文書幫小編給大家?guī)硪黄撐姆段模瑲g迎閱讀！
【摘要】 目的 觀察哮喘豚鼠肺和骨髓組織嗜酸粒細胞趨化因子受體3(CCR3)及嗜酸粒細胞(EOS)不同時相表達的變化, 探討哮喘發(fā)病的可能機制。方法 用卵白蛋白(OVA)和生理鹽水致敏法制備豚鼠哮喘和對照模型, 分為正常對照組(N)及哮喘組(A、B、C、D、E)，每組8只，于激發(fā)后30 min，6 h，12 h，24 h，48 h處死，瑞氏染色計數(shù)骨髓涂片和外周血涂片中EOS比例,免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測骨髓中CCR3的表達;制備豚鼠肺組織病理標(biāo)本, 蘇木精-伊紅染色,免疫組化檢測肺組織中CCR3的表達。結(jié)果 ①哮喘組骨髓和外周CCR3及EOS表達明顯增加;②OVA激發(fā)后,骨髓和外周CCR3及EOS表達：30 min變化不明顯，6 h，12 h達到峰值，24 h開始下降，48 h恢復(fù)正常水平;③骨髓的變化早于外周，CCR3的表達早于EOS的增多，且CCR3和EOS呈線性相關(guān)。結(jié)論 哮喘豚鼠肺組織和骨髓之間存在骨髓EOS細胞到循環(huán)再到肺組織的通路，CCR3表達增強, 為EOS從骨髓快速募集到肺組織提供了可能。
【關(guān)鍵詞】 支氣管哮喘 CCR3 EOS 骨髓 豚鼠
哮喘是多種細胞(如嗜酸粒細胞、肥大細胞、淋巴細胞、中性粒細胞和氣道上皮細胞等)和細胞組分參與的氣道慢性炎癥疾患，哮喘氣道炎癥的特征性改變?yōu)槭人崃＜毎?EOS)的浸潤和活化。氣道黏膜下的 EOS主要來源于骨髓CD34+干細胞在某些信號(如eotaxin,IL-5)的驅(qū)動下分化成熟為EOS，釋放入外周血，在多種趨化信號的引導(dǎo)下向肺內(nèi)定向募集。這一現(xiàn)象意味著從骨髓-循環(huán)-氣道，存在著調(diào)控EOS定向遷移的信號通路。在EOS趨化、募集于肺組織內(nèi)的過程中，嗜酸粒細胞趨化因子受體3(CCR3)起著重要作用。本實驗探討哮喘發(fā)作時骨髓和氣道之間的調(diào)控EOS定向遷移信號通路;為臨床開發(fā)治療哮喘新方法提供理論依據(jù)。
1 材料和方法
1.1 材料 雄性豚鼠48只, 體重(250±50) g,由徐州醫(yī)學(xué)院動物中心提供。隨機分為對照組(N)、哮喘組(根據(jù)處死時間分為A、B、C、D、E組), 每組8只。雞卵白蛋白(ovalbumin, OVA,美國Sigma公司)、CCR3多克隆抗體及SABC免疫組化試劑盒(武漢Boster公司) 、奧林巴斯圖像采集系統(tǒng)、德國百瑞霧化器和自制霧化箱。
1.2 方 法
1.2.1 哮喘模型的建立 哮喘組于第1天腹腔注射抗原混懸液1ml (OVA 100 mg、氫氧化鋁200 mg) , 2周后將豚鼠放于自制霧化吸入箱內(nèi), 噴射霧化吸入10 g/L OVA 20 min,連續(xù)5天[1]。對照組于第1天腹腔注射1 ml生理鹽水, 2周后噴射霧化吸入生理鹽水20 min,連續(xù)5天。最后1次霧化吸入后，哮喘組A、B、C、D、E分別于30 min，6 h，12 h，24 h，48 h處死動物,對照組12 h處死，取材并作相應(yīng)測定。
1.2.2 骨髓和外周血EOS計數(shù) 于末次激發(fā)后,斷頸處死豚鼠, 取頸動脈血制作血涂片。取兩側(cè)股骨, 去掉兩端骨骺, 剖開骨干髓腔,以含肝素100 U/ml的生理鹽水溶液將骨髓細胞沖洗出, 4℃,1000 r/min離心5 min后，沉渣涂于多聚賴氨酸處理的玻片上，干燥后以40 g/L多聚甲醛固定30 min,-20℃保存?zhèn)溆�。骨髓和外周血涂片用瑞氏染�? 隨機計數(shù)200個白細胞, 并計算其中EOS百分比。
1.2.3 骨髓細胞CCR3表達的檢測 采用SABC免疫組織化學(xué)法檢測骨髓中CCR3的表達。以兔抗大鼠CCR3 IgG為一抗, 以生物素化的羊抗兔IgG為二抗。取骨髓沉渣涂片, 按SABC免疫組化試劑盒說明書處理。在光鏡下觀察結(jié)果,胞膜為棕黃色者為陽性細胞, 在光鏡(×400) 下隨機選取5個視野, 計數(shù)陽性細胞數(shù)占白細胞總數(shù)的比例, 結(jié)果以±s表示。
1.2.4 肺組織EOS計數(shù)及CCR3表達的檢測 無菌操作下切取部分肺組織,40 g/L多聚甲醛固定, 常規(guī)石蠟包埋、切片, 分別進行H-E染色、CCR3免疫組化染色(嚴(yán)格按武漢Boster公司SABC試劑盒說明書操作)。肺組織切片H-E染色后, 每張切片計數(shù)200個細胞, 計算其中EOS百分比。免疫組化計數(shù)方法: 光鏡下觀察胞膜著棕黃色為陽性細胞。每例選擇1張染色較好的切片, 顯微鏡下隨機選取5個高倍視野(×400) , 計數(shù), 取每視野的均數(shù), 結(jié)果以±s表示。
1.2.5 統(tǒng)計學(xué)處理 計量數(shù)據(jù)均采用±s表示，用 Stata7.0軟件對數(shù)據(jù)進行t檢驗和相關(guān)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2 結(jié) 果
2.1 哮喘豚鼠氣道病理學(xué)改變 肺組織H-E染色光鏡下可見：與對照組相比，哮喘組大、中、小支氣管收縮,黏膜水腫，平滑肌增厚,上皮細胞腫脹,部分上皮細胞變性、壞死脫落,杯狀細胞增生,支氣管管腔狹窄甚至閉塞,黏液栓形成;支氣管周圍血管擴張、充血,黏膜、黏膜下層及肺泡區(qū)有大量的炎癥細胞浸潤,主要為EOS、淋巴細胞、單核細胞;肺泡間隔增厚。激發(fā)后30 min上述改變不明顯，6 h,12 h肺組織病變最明顯，24 h,48 h逐漸恢復(fù)到正常肺組織表現(xiàn)。見圖1。
2.2 外周血涂片、骨髓細胞涂片及肺組織EOS計數(shù) 結(jié)果見表1�？梢园l(fā)現(xiàn)哮喘(豚鼠)激發(fā)后30 min，與對照組相比變化不大，且外周血EOS百分比稍有下降，但無統(tǒng)計學(xué)意義;6 h,12 h升高明顯(P<0.01);24 h開始下降(P<0.05);48h基本恢復(fù)到正常水平。值得注意的是哮喘組不同時間點之間EOS也存在著變化：6 h較30 min，EOS升高明顯(P<0.01);12 h較6 h,肺組織EOS變化不大(P>0.05),骨髓和外周血升高(P<0.05);24 h較12 h，48 h較24 h,EOS呈下降趨勢(P<0.01).可以看出在6 h,12 h時EOS增多最明顯，與氣道病理學(xué)改變相一致，24 h開始下降，48 h回到正常水平。骨髓的變化先于肺和外周血，且持續(xù)的時間短。
2.3 肺組織和骨髓中CCR3蛋白的表達 結(jié)果見表2。 哮喘組肺組織和骨髓中CCR3 蛋白陽性細胞呈棕黃色,主要定位于細胞膜。肺組織中，氣道黏膜、黏膜下層及血管周圍、肺泡區(qū)有大量呈棕黃色的陽性細胞,氣道黏膜上皮細胞、血管內(nèi)皮細胞及平滑肌細胞也有CCR3蛋白表達,對照組在上述部位僅少量表達。骨髓細胞中,呈棕黃色CCR3 蛋白陽性細胞大量表達于各階段Eos細胞表面，見圖2。不同之間點的表達趨勢和EOS的變化一致：與對照組相比骨髓及肺組織中CCR3 30 min時開始升高(P<0.05); 6 h、12 h達到高峰(P<0.01);24 h開始下降(P<0.05);48 h基本恢復(fù)到正常水平。哮喘組不同時間點之間CCR3表達也存在著變化：6 h較30 min升高明顯(P<0.01);12 h較6 h,肺組織繼續(xù)升高(P<0.05),骨髓中持續(xù)高峰(P>0.05);24 h較12 h，48 h較24 h漸下降至正常水平(P<0.01)。骨髓先升高，肺組織隨著變化，但持續(xù)時間長于骨髓。 表1 對照組、哮喘組的EOS計數(shù)表2 肺組織和骨髓中CCR3 蛋白的表達2.4 肺組織和骨髓EOS表達與CCR3蛋白表達的關(guān)系 EOS表達與CCR3蛋白的表達存在著線性關(guān)系：肺組織，r=0.93,P<0.01;骨髓，r=0.95,P<0.01。
3 討 論
CCR3主要由單一肽鏈組成的7個螺旋跨膜結(jié)構(gòu)，屬于G 蛋白藕聯(lián)受體家族。CCR3 主要表達于EOS上，介導(dǎo)其遷移及脫顆粒反應(yīng)。Shannon A 等[2]研究發(fā)現(xiàn)eotaxin及eotaxin-2 通過與CCR3的結(jié)合可以誘導(dǎo)部分CCR3內(nèi)陷和EOS 的變形，有助于EOS 的活化和遷移。Joubert P 等[3]發(fā)現(xiàn)eotaxin 作用于氣道平滑肌細胞CCR3可誘導(dǎo)平滑肌細胞遷移和增殖，使細胞內(nèi)Ca2+增高。Adachi T 等[4]發(fā)現(xiàn)支氣管上皮細胞表達CCR3 可激活和誘導(dǎo)有絲分裂原激活蛋白(MAP)活化和細胞因子的產(chǎn)生。可見CCR3無論在氣道炎癥還是重塑方面都起到了重要作用。本實驗發(fā)現(xiàn)哮喘時不但肺組織EOS浸潤明顯，CCR3表達增加，而且黏膜上皮細胞、平滑肌細胞上CCR3也有明顯表達，平滑肌增厚，和既往研究一致。
以往研究表明, 在過敏性哮喘患者的骨髓中, 成熟和非成熟的EOS CCR3表達水平顯著升高[5]。Lamkhioued等[6]研究證實,CCR3 可表達于骨髓CD34+造血細胞表面,在體內(nèi)外eotaxin 與CCR3 結(jié)合后均表現(xiàn)出明顯的趨化活性,促使骨髓中CD34+細胞產(chǎn)生增多。并且單獨或與IL-5協(xié)同作用可以使骨髓CD34+祖細胞定向分化為EOS，并向外釋放、募集[7]。本實驗發(fā)現(xiàn)哮喘組骨髓CCR3表達明顯高于對照組，與EOS各級細胞呈線性相關(guān)，并且CCR3的表達高峰在6 h,早于EOS增加，釋放的高峰時間12 h，說明在某些因子的作用下，骨髓祖細胞表達CCR3，進一步使EOS分化、釋放增多，利于炎癥的發(fā)展。
近年研究的重點傾向于骨髓、肺組織、循環(huán)之間的關(guān)系，以便更好地為治療哮喘開闊思路。本實驗發(fā)現(xiàn)無論肺組織還是骨髓在哮喘激發(fā)初始時變化不明顯，但是外周血EOS呈下降趨勢，考慮為向肺內(nèi)募集量大于骨髓釋放量;在6 h后，骨髓CCR3和EOS均明顯增加，外周血EOS增多，肺內(nèi)表達增多，12 h達到高峰，24 h開始下降，說明伴隨骨髓干細胞CCR3表達增加，EOS增多、釋放，外周的EOS也在變化。證明在骨髓到外周血再到肺組織存在著密切的細胞信號環(huán)路聯(lián)系。如果能切斷這方面的環(huán)路，如通過抑制CCR3的表達，或者給于其拮抗劑，將對哮喘的治療有很重要的意義。
【CCR3在哮喘豚鼠模型肺和骨髓中的表達及意義】相關(guān)文章：
肺熱的癥狀和治療方法10-06
小豚鼠作文12-01
可以清肺養(yǎng)肺的水果10-26
清肺養(yǎng)肺的水果有哪些10-26
小豚鼠作文通用11-24
淺析高中生物模型構(gòu)建的的意義與誤區(qū)10-05
學(xué)習(xí)的意義和作用08-09
可愛的小豚鼠小學(xué)作文10-08
形象模型10-26
老人對肺好的食物04-21