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九香止瀉腸溶片對(duì)副溶血弧菌活性及小鼠小腸功能亢進(jìn)模型的影響論
目的 探討九香止瀉腸溶片對(duì)副溶血弧菌活性以及對(duì)新斯的明所致的小鼠小腸功能亢進(jìn)的影響。方法 采用瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定抑菌圈直徑，液體培基測(cè)定法與平皿傾注法測(cè)定最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）；給小鼠皮下注射甲硫酸新斯的明0.15 mg/kg造成小腸功能亢進(jìn)造模，灌胃10％炭末生理鹽水，測(cè)定小腸推進(jìn)率。結(jié)果 九香止瀉腸溶片在50 mg/mL濃度對(duì)副溶血弧菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗菌作用，其作用優(yōu)于腸康片，MIC為50 mg/mL，MBC為500 mg/mL；與模型組比較，九香止瀉腸溶片各劑量組小腸推進(jìn)率顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；其中高劑量組明顯優(yōu)于腸康組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 九香止瀉腸溶片具有顯著的抗副溶血弧菌活性、抑制小腸功能亢進(jìn)作用。〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ To investigate the effect of Jiuxiang Zhixie granule（JZG） on vibrio parahaemolyticus activity and the small intestinal hyperfunction induced by neostigmine in mice. Methods The diameter size of inhibition circle was measured with agar diffusions, and minimum inhibitory concentration(MIC) and minimum bactericidal concentration(MBC) were detected with fluid medium determination method; The model was induced by hypodermic injection 0.15 mg/kg of neostigmine methylsulfate, and the pushing rate of small intestine in mice was measured after intragastric infusion with 10％ Charcoal-powder saline. Results JZG in 50 mg/ml concentration was stronger to inhibit and kill vibrio parahaemolyticus, which was more effective than Changkang tablet. The MIC concentration was 50 mg/ml, the MBC concentration 500 mg/mL. Compared with the model group, the pushing rate of small intestine in each dosage of JZG group was lower obviously(P<0.05). The medium and high dosage groups were more effective than that in Changkang group(P<0.05). Conclusions JZG is very effective to inhibit activity of vibrio parahaemolyticus, and depress the propellent function of small intestine.
〔Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ〕 Jiuxiang Zhixie granule; marine vibrio; antisepsis; neostigmine; propellent function of small intestine; mice; Cortex Fraxini; cortex toonae 急性腹瀉的發(fā)病原因多為感染性腹瀉，細(xì)菌感染引起的腹瀉占感染性腹瀉多數(shù)。致瀉性海洋弧菌引起的急性腹瀉發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，副溶血弧菌就是其中一種致瀉性海洋弧菌。九香止瀉腸溶片主治濕熱瀉泄，其臨床療效確切、安全。擬九香止瀉腸溶片對(duì)副溶血弧菌活性的影響及其對(duì)新斯的明引起的小鼠小腸功能亢進(jìn)模型的影響進(jìn)行研究�，F(xiàn)將實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果報(bào)道如下。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 藥物 九香止瀉腸溶片干浸膏，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院藥劑教研室提供，由秦皮、香椿皮等藥組成藥物濃度為每克浸膏含5 g生藥，批號(hào)：20050811，臨床推薦劑量為3 g生藥/次，3次/d，3 d為1個(gè)療程；腸康片，湖南湘泉制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：20050201；諾氟沙星膠囊，福建古田藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：060106-4；甲硫酸新斯的明注射液，上海信誼金朱藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：030501。
1.1.2 動(dòng)物 昆明種小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)提供。許可證號(hào)：SCXK(湘)2003-0003，均在日常條件下飼養(yǎng) 3 d后進(jìn)行試驗(yàn)。
1.1.3 菌種 副溶血弧菌由湖南省商品進(jìn)出口檢驗(yàn)檢疫局食品檢驗(yàn)檢疫科提供，購(gòu)自大連海事檢驗(yàn)中心，批號(hào)：20050603。
1.1.4 試劑與儀器 瓊脂；NaCl；墨汁；無(wú)菌注射用水；生物顯微鏡；超凈工作臺(tái)；血球計(jì)數(shù)板；抗菌實(shí)驗(yàn)用瓊脂打孔器（Φ6 mm）；柳葉刀；游標(biāo)卡尺等。
1.2 方法
1.2.1 九香止瀉腸溶片對(duì)致瀉性海洋弧菌的檢測(cè)方法[1] （1）菌液制備 將副溶血弧菌菌種在3.5％NaCl肉湯瓊脂培養(yǎng)基中增菌，37 ℃培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的菌液。使用時(shí)用麥?zhǔn)嫌?jì)數(shù)法，將菌液濃度調(diào)整為1×109個(gè)/mL。（2）抑菌實(shí)驗(yàn) 采用瓊脂擴(kuò)散法（打孔法）。制備我妻氏血瓊脂平板，無(wú)菌檢查后，進(jìn)行抗菌實(shí)驗(yàn)：取0.1 mL副溶血弧菌菌液（菌液濃度為1.5×109 cfu/mL）均勻涂布整個(gè)培養(yǎng)基表面，用直徑6 mm無(wú)菌打孔器在我妻氏血瓊脂平板的表面打孔，每個(gè)平板上打3孔，各孔中心相距約24 mm，每孔加入300 μL藥液（藥液濃度為1 g/mL），于37 ℃培養(yǎng)24 h后，觀察抑菌圈的有無(wú)，用游標(biāo)卡尺準(zhǔn)確量取抑菌圈直徑，同樣操作重復(fù)9次，同時(shí)設(shè)諾氟沙星膠囊和腸康片對(duì)照孔。（3）藥物的MIC測(cè)定 ①采用液體培基測(cè)定法測(cè)定藥物的MIC。制備3.5% NaCl肉湯培養(yǎng)基：NaCl 3.5 g加入布氏肉湯培基100 mL中即得，加熱溶解，分裝于試管，每管1 mL，121 ℃、1.05 kg/cm2高壓滅菌15 min備用。②將九香止瀉腸溶片無(wú)菌干粉用注射用無(wú)菌用水溶解成1 g/mL，實(shí)驗(yàn)用3.5% NaCl肉湯培養(yǎng)基將藥液進(jìn)行對(duì)倍稀釋1∶2，1∶4，1∶8，1∶16，1∶32，1∶64，1∶128，1∶256，1∶512，1∶1024，共10管。同時(shí)設(shè)含菌不加藥的菌液對(duì)照，加藥不加菌的藥物對(duì)照，培養(yǎng)基作對(duì)照。③每管加入0.05 mL副溶血弧菌菌液，置37 ℃、培養(yǎng)24 h，肉眼觀察，以能抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最高藥物稀釋倍數(shù)即為最低抑菌濃度（MIC）。（4）藥物的MBC測(cè)定 取MIC以上無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)物0.1 mL，傾注于不含藥物的我妻氏血瓊脂培養(yǎng)基，待培基冷凝后，置37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察有無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，以無(wú)菌生長(zhǎng)的濃度即為藥物的最低殺菌濃度（MBC）。
1.2.2 九香止瀉腸溶片對(duì)新斯的明所致的小鼠小腸功能亢進(jìn)的實(shí)驗(yàn)方法[2] （1）動(dòng)物分組及給藥方法 取小鼠60只，雌雄各半，編號(hào)、稱體質(zhì)量后，按體質(zhì)量排序，性別、體質(zhì)量分層后按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為6組：空白對(duì)照組、模型組、腸康片組、九香止瀉腸溶片低、中、高劑量組（以下簡(jiǎn)稱低、中、高劑量組），每組10只。九香止瀉腸溶片低、中、高劑量組分別以相當(dāng)于臨床等效劑量1、3、9倍濃度（1.17 g/kg、3.51 g/kg、10.53 g/kg）灌胃給藥，腸康片組以相當(dāng)于臨床等效劑量3倍濃度給藥（0.94 g/kg），小鼠灌胃體積為20 mL/kg，實(shí)驗(yàn)前小鼠禁食不禁水24 h，實(shí)驗(yàn)開(kāi)始各治療組均按計(jì)算出的劑量分2次灌胃相應(yīng)藥物給藥，給藥間隔4 h；空白對(duì)照組和模型組灌胃同體積蒸餾水；模型組與各治療組每只小鼠均皮下注射甲硫酸新斯的明0.15 mg/kg。15 min后，各組小鼠均灌胃10％炭末生理鹽水，體積為10 mL/kg，20 min后處死，測(cè)量每組小鼠小腸長(zhǎng)度和炭末前端至幽門(mén)的推進(jìn)距離，計(jì)算炭末在小腸的推進(jìn)率。（2）檢測(cè)指標(biāo) 小鼠小腸長(zhǎng)度、炭末推進(jìn)長(zhǎng)度、計(jì)算小腸推進(jìn)百分率。
P＝小腸炭末推進(jìn)長(zhǎng)度（cm）/小腸全長(zhǎng)(cm)×100％。
百分率數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，以百分率的平方根的反正弦數(shù)值（Arcsin）為統(tǒng)計(jì)指標(biāo)。
1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示（ｘ±ｓ）。
2 結(jié)果
2.1 九香止瀉腸溶片對(duì)致瀉性海洋弧菌活性的影響
2.1.1 抑菌實(shí)驗(yàn) 結(jié)果顯示，九香止瀉腸溶片組抑菌圈直徑顯著大于腸康片組；九香止瀉腸溶片組、腸康片組抑菌圈直徑小于諾氟沙星膠囊組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果見(jiàn)表1。
2.2.2 MIC及MBC測(cè)定 結(jié)果顯示，九香止瀉腸溶片干浸膏對(duì)副溶血弧菌的MIC為50 mg/mL，MBC為100 mg/mL，腸康片MIC為500 mg/mL，諾氟沙星膠囊MIC為5 μg/mL。九香止瀉腸溶片在一定濃度下對(duì)副溶血弧菌表現(xiàn)出了較強(qiáng)的抗菌作用。如圖1。
2.2 九香止瀉腸溶片對(duì)新斯的明所致的小鼠小腸功能亢進(jìn)的影響
實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組與空白對(duì)照組比較，小腸推進(jìn)率明顯提高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；腸康片組、九香止瀉腸溶片低劑量組、中劑量組、高劑量組與模型組比較，小腸推進(jìn)率明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；九香止瀉腸溶片中劑量組、高劑量組與腸康片組比較，小腸推進(jìn)率明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；見(jiàn)表2。
3 討論
九香止瀉腸溶片主要由秦皮、香椿皮等組成的復(fù)方。秦皮苦、辛，平，具有清熱、解毒、止痢、明目等功效。主治泄瀉，痢疾，白帶，目赤等�，F(xiàn)代藥理研究證實(shí)，秦皮揮發(fā)油具有抗菌消炎、抗腫瘤的生物學(xué)活性。椿皮苦、澀、寒，具有清熱燥濕，收澀止帶，止瀉，止血，殺蟲(chóng)之功效。臨床主要用于濕熱瀉痢，赤白帶下，久瀉久痢，腸風(fēng)便血，崩漏帶下，外用可燥濕殺蟲(chóng)止癢，治瘡癬[3]。香椿皮主要含川楝素、甾醇、鞣質(zhì)等。其主要成分為臭椿苦內(nèi)酯等，現(xiàn)代藥理研究證明，香椿煎劑可以抑制和殺滅金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌、傷寒桿菌、痢疾桿菌等[4]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，實(shí)驗(yàn)平皿肉眼可見(jiàn)明顯的抑菌圈，九香止瀉腸溶片對(duì)副溶血弧菌的MIC是50 mg/mL；MBC是100 mg/mL，說(shuō)明九香止瀉腸溶片對(duì)副溶血弧菌有明顯的抑菌作用。前期我們已經(jīng)做了九香止瀉腸溶片對(duì)痢疾桿菌、大腸桿菌等常見(jiàn)相關(guān)細(xì)菌的抑菌實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明抑菌作用顯著，相關(guān)實(shí)驗(yàn)將在其它論文發(fā)表。而細(xì)菌感染是引起急性腹瀉的主要病因。提示九香止瀉腸溶片可能通過(guò)抑制或殺滅致瀉性細(xì)菌從而達(dá)到止瀉之目的。
新斯的明具有抗膽堿酯酶作用，能可逆性的與膽堿酯酶結(jié)合，使內(nèi)源性乙酰膽堿（Ach）在體內(nèi)堆積，表現(xiàn)出Ach作用。因尚能直接作用于骨骼肌細(xì)胞的膽堿能受體，故對(duì)骨骼肌作用較強(qiáng)；縮瞳作用較弱。多用于重癥肌無(wú)力及腹部手術(shù)后的腸麻痹[5]。在本實(shí)驗(yàn)中我們利用其作為腸功能亢進(jìn)的造模藥物。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，九香止瀉腸溶片低、中、高劑量組與新斯的明模型組比較，小腸推進(jìn)率明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說(shuō)明九香止瀉腸溶片具有抑制新斯的明引起的腸功能亢進(jìn)的作用。
近年來(lái)應(yīng)用少數(shù)民族特色中草藥治療急性腹瀉的報(bào)道逐漸增多，其應(yīng)用前景較為廣泛，因此，九香止瀉腸溶片是根據(jù)少數(shù)民族名老中醫(yī)應(yīng)用多年的經(jīng)驗(yàn)方而制成之制劑，臨床應(yīng)用多年療效對(duì)比觀察，提示該藥對(duì)于濕熱瀉泄具有非常好的療效。前期動(dòng)物毒性實(shí)驗(yàn)研究提示其長(zhǎng)期口服安全，無(wú)明顯毒副作用，推薦的臨床使用劑量基本安全，無(wú)毒副作用[6]。本實(shí)驗(yàn)研究提示該藥具有良好的抗菌、消炎等作用，為應(yīng)用于臨床提供了可靠的科學(xué)理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
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